RANi沉默S100A9对U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新的影响及机制研究

发布时间：2020-06-12 04:16

【摘要】：目的恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,具有病程短、进展快、预后差等特点,目前的多种治疗手段都无明显的效果,严重威胁着人类的生命健康,2年生存率不足30%。最近肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的发现为胶质瘤的诊断和治疗提供了新的策略与方向。研究发现在胶质瘤中存在着一群胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs),虽然含量极少,却具有无限增殖、自我更新、多向分化和重建肿瘤的能力,与肿瘤的发生发展、侵袭转移、放化疗抵抗和肿瘤复发相关。因此杀灭胶质瘤干细胞可能成为治愈胶质瘤的一种可行的手段。本课题组在前期蛋白组学研究中发现钙结合蛋白S100A9在胶质瘤干细胞中显著上调,靶向干扰S100A9后胶质瘤增殖能力下降。S100A9蛋白属钙结合蛋白S100家族成员,广泛参与细胞骨架构建,钙离子稳态调节、分化及炎症反应等,与肿瘤关系密切。本研究采用shRNA-S100A9慢病毒感染人U87胶质瘤干细胞,观察U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力,并揭示其作用的潜在机制。方法构建沉默S100A9基因的质粒(含S100A9基因沉默序列3个和阴性对照序列1个),采用三质粒系统包装沉默S100A9基因的慢病毒并感染人U87胶质瘤干细胞。荧光显微镜观察感染后细胞绿色荧光表达,嘌呤霉素对感染后的U87胶质瘤干细胞进行筛选,获取带嘌呤霉素抗性细胞克隆进行培养。通过实时定量PCR技术(RT-qPCR)检测S100A9mRNA的表达,免役印迹技术(Western blot)检测S100A9蛋白的表达。本实验分组如下:空白组、对照组、实验组。空白组:未作任何处理的U87胶质瘤干细胞,对照组:转染空载质粒的U87胶质瘤干细胞,实验组:shRNA-S100A9-1、shRNA-S100A9-2、shRNA-S100A9-3。MTT法检测细胞体外的增殖,干细胞成球实验检测细胞自我更新能力,RT-qPCR和Western blot分别检测β-catenin mRNA和蛋白的表达。结果慢病毒感染后实验组U87胶质瘤干细胞S100A9 mRNA和蛋白表达受到明显抑制。与对照组比较:实验组细胞增殖变慢(P0.05),干细胞成球能力受到明显抑制(P0.05),β-catenin mRNA和蛋白的表达显著下调(P0.05)。数据有统计学意义。结论靶向干扰S100A9后能够明显抑制U87胶质瘤干细胞的体外增殖、自我更新,其机制可能与抑制wnt/β-catenin信号通路转导相关,提示S100A9可能作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点。
【图文】：

免疫荧光,胶质瘤,干细胞,显微镜

C D图 1 U87 胶质瘤干细胞免疫荧光鉴定 100×(A:MERGE; B:DAPI; C:NESTIN; D:SOX-2)Fig. 1 Immunofluorescence Identification of U87 Glioma Stem Cells 100×(A:MERGE; B:DAPC:NESTIN; D:SOX-2)2.2 转染后各组细胞荧光显微镜采图（图 2）

慢病毒感染

27D图 2 慢病毒感染后各组细胞荧光表达 100×（A:sh-NC; B:shRNA-S100A9-1;C:shRNA-S100A9-2; D:shRNA-S100A9-3)Fig. 2 Cell fluorescence expression after lentivirus infection 100×（A:sh-NC;B:shRNA-S100A9-1; C:shRNA-S100A9-2; D:shRNA-S100A9-3)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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