Smarcdl在胶质母细胞瘤增殖、侵袭及化疗耐受性中的作用和机制研究

发布时间：2020-06-12 04:53

【摘要】：胶质母细胞瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤,具有高度的增殖、侵袭及化疗耐受性,呈浸润性生长方式。尽管手术做到最大范围的安全切除,辅以术后放化疗及电场治疗,患者的预后仍然较差并且不可避免的出现肿瘤复发。胶质母细胞瘤患者的中位生存期一般在20个月之内;若出现肿瘤复发,其中位生存时间将不超过12个月。2016年WHO对中枢神经系统肿瘤进行重新分级,强调了分子病理在分型中的地位,因此寻找胶质母细胞瘤的新的分子标志物并以此作为靶点的治疗策略急需被发掘来预测和改善患者的预后,是当代神经外科所面临的巨大挑战。Smarcd1作为SWI/SNF染色质重塑蛋白家族重要的结构亚基,在多种恶性肿瘤中表达均下降,可促进肿瘤增殖,增加化疗耐受性,具有抑癌基因的功能。Notch1信号通路在胶质母细胞瘤中表达升高,对于维持肿瘤恶性表型具有重要作用。因此,本研究将以染色质重塑蛋白smarcd1为切入点,探讨其对胶质母细胞瘤增殖、侵袭及化疗耐药性的作用,并从smarcd1与Notch1信号通路的交互对话角度阐明smarcd1发挥抑癌作用的机制。本课题将从以下五个部分进行研究:第一部分Smarcd1在胶质瘤临床标本及细胞系中表达情况研究目的:探究smarcd1在胶质瘤标本及细胞系中表达情况,构建慢病毒敲减及过表达smarcd1细胞系。方法:通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR),蛋白质免疫印记(western b1ot),免疫荧光染色方法比较:1)手术切除胶质瘤标本和癌旁正常脑组织标本中smarcd1表达情况;2)U87、U251胶质母细胞瘤细胞系和正常星形胶质细胞系中smarcd1表达情况。采用smarcd1敲减及过表达慢病毒转染U87及U251细胞,构建稳转细胞系,并运用上述实验方法验证病毒转染效率。结果:同正常脑组织相比,smarcd1在高级别胶质瘤中表达明显降低;在U87和U251细胞中smarcd1表达水平较星形胶质细胞系下降。慢病毒敲减及过表达smarcd1效率均明显,具有统计学意义。结论:同正常脑组织及星胶细胞系相比,smarcd1在高级别胶质瘤及胶质母细胞瘤细胞系中均明显下降。第二部分Smarcd1在胶质母细胞瘤增殖及侵袭中的作用研究目的:探究smarcd1对胶质母细胞瘤细胞增殖及侵袭的影响和具体分子机制。方法:通过CCK-8及克隆形成实验检测敲减及过表达smarcd1对体外细胞增殖的影响,裸鼠皮下成瘤实验验证smarcd1在体内环境下对增殖的作用。流式细胞技术检测smarcd1差异表达对肿瘤细胞周期进程的影响。通过Transwell实验检测smarcd1对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响,利用western blot验证细胞周期相关蛋白CDK4和Cyclin D1以及细胞侵袭相关蛋白Vimentin、β-Catenin、N-Cadherin、E-Cadherin 和 ZO-1 的表达水平变化。结果:在体内及体外实验中smarcd1敲减后细胞增殖能力明显上升,而过表达smarcd1后细胞增殖能力受损。高表达smarcd1时胶质母细胞瘤细胞在有丝分裂G1期阻滞。同时低表达smarcd1增加胶质瘤细胞的侵袭性,而smarcd1过表达后细胞侵袭性明显下降。结论:敲减smarcd1增加胶质瘤的增殖及侵袭性,而过表达smarcd1不利于肿瘤增殖和侵袭。第三部分Smarcd1对胶质母细胞瘤化疗敏感性的作用和机制研究目的:探究smarcd1的表达差异在胶质母细胞瘤进行替莫唑胺化疗后产生凋亡水平变化的作用机制。方法:通过流式细胞技术检测敲减及过表达smarcd1细胞中凋亡水平以及经过替莫唑胺处理后细胞凋亡情况变化。CCK-8实验验证替莫唑胺处理后smarcd1差异表达引起细胞存活率的变化。Western blot检测替莫唑胺处理后细胞凋亡相关蛋白Bcl-xl、Bax、Cleaved-Caspase3和p21的表达情况。免疫共沉淀实验检测smarcd1与抑癌蛋白p53直接结合作用。结果:替莫唑胺处理后,smarcd1敲减细胞较对照细胞凋亡明显下降,细胞活性上升,促凋亡蛋白表达减少,抗凋亡蛋白表达上升,与p53蛋白结合减少;而过表达smarcd1显著增加替莫唑胺引起的细胞凋亡,细胞活力下降,与p53蛋白结合增加。结论:Smarcd1表达减少能够降低胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗的敏感性,而过表达smarcd1提高化疗敏感性,其作用机制可能与p53结合状态有关。第四部分Smarcd1-Notch1信号通路交互对话引起胶质母细胞瘤生物学行为变化的机制研究目的:探究胶质母细胞瘤中smarcd1与Notch1信号通路的互相调控关系及对细胞增殖和侵袭性的影响。方法:通过qRT-PCR、western blot实验检测敲减及过表达smarcd1细胞中Notch1及其通路下游蛋白Hes1和Hey1的表达变化;CCK-8及Transwell实验检测Notch1活化特异性抑制剂DAPT处理后细胞增殖和侵袭能力的变化。运用Notch1 基因 siRNA 及 DAPT 降低 Notch1 表达,通过 qRT-PCR、western blot 实验检测smarcd1、Hes1和Hey1的表达情况。免疫荧光验证Notch1抑制后,Hes1和smarcd1的表达强度。Hes1 siRNA转染胶质母细胞瘤后,qRT-PCR、westerm blot和免疫荧光实验检测smarcd1的表达水平。结果:Smarcd1敲减后Notch1及其通路下游Hes1、Hey1转录表达上升,过表达smarcd1后,Notch1信号通路活化下降;且DAPT抑制Notch1活化可以有效逆转敲减smarcd1引起的细胞增殖及侵袭能力上升。抑制Notch1活化及通路下游蛋白Hes1后,smarcd1表达上升。结论:胶质母细胞瘤中存在smarcd1与Notch1负反馈调控通路,其交互对话增加肿瘤的恶性表型。第五部分Smarcd1对染色质结构及基因表达的作用机制研究目的:探究smarcd1对胶质母细胞瘤染色质结构的影响及smarcd1参与基因转录表达的作用。方法:通过细胞免疫荧光实验检测组蛋白H3K4me3、H3K27me3、H3ac及异染色质蛋白HP-1α的表达分布情况。通过染色质免疫共沉淀结合二代基因测序(ChIP-seq)实验筛选smarcd1可能的靶基因;qRT-PCR验证目的基因表达效率。Western blot检测靶基因IL-9R及所参与的STAT3信号通路的表达情况。结果:Smarcd1敲减细胞中促进染色质活化的组蛋白H3ac和H3K4me3荧光强度上升,促进染色质凝集的组蛋白H3K27me3和异染色质蛋白HP-1α表达减少,而过表达smarcd1则使染色质更趋近凝集状态。ChIP实验证明smarcd1与IL-9R基因直接结合,参与IL-9R的转录调控;敲减smarcd1后IL-9R表达上升,STAT3信号通路明显活化。结论:Smarcd1作为SWI/SNF染色质重塑蛋白家族重要结构亚基,其表达能够促进染色质凝集。另外,smarcd1直接结合于IL-9R基因上,抑制IL-9R转录表达及下游STAT3信号活化。总结本课题研究从临床样本到细胞系,证实smarcd1在胶质母细胞瘤中呈低表达状态。通过细胞系中敲减和过表达smarcd1,进一步证实smarcd1-Notch1交互对话在胶质母细胞瘤中持续存在,增加肿瘤增殖、侵袭及化疗耐受性。Smarcd1可以促进染色质结构凝集,与IL-9R基因直接结合,参与调控基因转录表达。因此,smarcd1可作为重要的抑癌基因,为胶质母细胞瘤治疗提供新的靶点。
【图文】：

；，构的。逡逑１．４ＩＮＯ８０蛋白家族逡逑ＩＮＯ８０邋（ＩＮＯｓｉｔｏｌ邋ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ邋８０）是最新发现的一类能够调控肌糖反应基因表逡逑达的染色质重塑蛋白家族，主要由ＩＮＯ８０、ＳＲＣＡＰ和ｐ４００复合物组成，每个复逡逑合物都由１０个左右亚基构成，产生特异性生理功能［２５］。ＩＮＯ８０复合物主要参与逡逑ＤＮＡ双链修复，并能作为转录因子促进核小体识别（由ＡＲＰ５和ＩＥＳ６亚基参与）逡逑以及组蛋白偶联（由ＡＲＰ３Ｂ和ＡＲＰ８亚基参与）蛋白的转录表达。ＳＣＲＡＰ复合逡逑物在ＤＮＡ损伤反应中特异性的催化组蛋白Ｈ２Ａ产生异构反应，调控细胞周期逡逑检查点（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）邋Ｐ４００复合物通过催化组蛋白乙酰化迅速募集至ＤＮＡ逡逑双链断裂处，使核小体结构松散，促进ＤＮＡ修复元件结合并修复受损ＤＮＡ［２７】。逡逑综上，ＩＮＯ８０染色质重塑蛋白家族能够促进基因转录，修复受损ＤＮＡ以及重建逡逑核小体结构，在先天疾病以及肿瘤生成中起重要作用。逡逑？逦？邋ＶＭＭＯｌ逡逑？

能够通过减少ｓｍａｒｃｄｌ的表达，明显降低顺铂诱导的细胞凋亡发生比例。过表达逡逑ｓｍａｒｃｄｌ后顺怕引起的凋亡明显增加，具体机制为ｓｍａｒｃｄｌ作为共转录因子增加逡逑ｐ５３及其下游基因的表达（图１．４）。这些结果表明ｓｍａｒｃｄｌ可以作为肿瘤化疗耐逡逑受的敏感１Ｃ点，增加ｓｍａｒｃｄｌ的表达，提高ｐ５３的转录活性，可以使化疗药物取逡逑得更好的疗效［８４］。逡逑ＥＧＦＲ逡逑ｆ邋Ｐ５３逡逑ｍｉＲ－７邋ｍ－ｒｎ－邋逦４邋（＾ＳＭＡＲＣＤｌ邋）邋逦邋？邋Ｐ２１＃邋ＢＡＸ逡逑ｎｍｒ逦ｍｍ？逦？逦逡逑Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋１逡逑ＳＭＡＲＣＤ１邋ｍＲＮＡ逡逑图１．４肺癌中ｓｍａｒｃｄｌ调控ｐ５３参与化疗耐受性的作用机制［８４］。逡逑在高级别卵巢浆液性癌中，，研宄发现相对于良性卵巢癌，ｍｉＲ－２２３表达升高，逡逑而ｓｍａｒｃｄｌ表达下降。当在细胞中过表达ｍｉＲ－２２３后，ｓｍａｒｃｄｌ转录水平下降３逡逑倍以上，这些结果验证了邋ｍｉＲ－２３３通过调控ｓｍａｒｃｄｌ的表达促进卵巢癌的发生，逡逑但其中的分子机制仍不明确ｆ８５］。逡逑３．５总结逡逑Ｓｍａｒｃｄｌ作为ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白家族的重要结构亚基，既可以参与桥接靶基因逡逑与ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物的结合，也可以独立发挥多种生物学作用。Ｓｍａｒｃｄｌ调控染逡逑色质重塑，改变组蛋白修饰表达，或者直接结合靶基因启动子区域行使转录因子逡逑功能。在肿瘤恶性表型和化疗耐药、肝脏生物代谢以及胚胎干细胞分化等方面发逡逑挥重要作用。但针对ｓｍａｒｃｄｌ的研宄在Ｐｕｂｍｅｄ上也仅不足百篇
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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本文编号：2709028