自噬在N-乙酰半胱氨酸萝卜硫素抗胶质母细胞瘤中的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-13 04:39

【摘要】：脑胶质瘤是最常见的恶性原发性神经系统肿瘤,占恶性脑肿瘤的81%,是一种破坏性极强的颅内肿瘤,并以其高度侵袭性而闻名。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)依据其恶性程度,将神经胶质瘤分为I-IV级。多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是WHO IV级胶质瘤之一,其以肿瘤细胞的快速生长为特征,是最常见和最致命的成人脑肿瘤。胶质母细胞瘤常常位于脑皮层下部,呈浸润性生长,并且侵入数个脑叶和深部大脑结构,与周围正常脑组织无明显界限。因此,在临床实践中,显微手术难以完整分离和切除肿瘤组织,导致患者出现肿瘤复发且预后极差。迄今为止,化学治疗已成为旨在解除肿瘤占位效应的手术后的主要治疗方式。然而,GBM经常出现出化疗耐药性,使得患者在治疗后的存活率和生存期皆不理想。肿瘤是一系列的全身反应症状的系统性疾病,其主要特征是肿瘤细胞极快的生长速度和无限增殖的能力。微管在细胞生长周期中扮有重要角色,是治疗肿瘤的重要靶点。由α-、β-tubulin蛋白异二聚体聚合而成的微管,是组成细胞骨架的基本元件。它在细胞增殖,细胞形态维持,细胞内物质转运等细胞功能中扮有重要角色。在细胞增殖的DNA合成后期(G2期),由微管作为主要构成成分的中心体于细胞两级形成纺锤体,调节细胞有丝分裂,对维持染色体的稳定起着重要的作用。当微管结构遭到破坏,纺锤体形成异常致使细胞正常生理功能紊乱,细胞分裂阻滞于G2期,无法正常进入下一细胞周期,导致细胞死亡。α-tubulin作为组成微管结构的异构体之一,在人体内存在有多种亚型。研究发现,人体组织中至少有15种基因亚型编译α-tubulin蛋白,最常见的有TUBA1A、TUBA1B、TUBA1C、TUBA3D、TUBA3E、TUBA4A、TUBA8等。不同的基因亚型在不同的组织中含量不同,也参与不同的细胞功能。值得关注的是,在最近的一项研究中发现,TUBA1B的表达量与肺癌患者的临床预后密切相关,说明TUBA1B是肺癌的癌基因。目前,未见TUBA1B在胶质瘤患者中临床信息分析的报道。流行病学研究发现,来自十字花科类植物的萝卜硫素(sulforaphane,SFN)及其衍生物,在预防癌症和抗肿瘤中发挥重要作用。它是迄今为止人类在自然植物中发现的抗癌能力最强的化合物。多项研究证实,在包括肺癌,膀胱癌,皮肤癌,肾癌等多种肿瘤细胞中,SFN可以通过多种信号转导途径,抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞死亡。SFN经人体代谢可生成半胱氨酸萝卜硫素(Sulforaphane-cysteine,SFN-Cys)和N-乙酰半胱胺酸萝卜硫素(Sulforaphane-N-acetyl-L-cysteine SFN-NAC)等代谢物。在各组织中,SFN以其代谢物为主要存在形式。这些代谢物在人体内具有更高的血浆浓度和更长的药物半衰期。意味着它们可能具有更好的抗肿瘤效果。本研究使用SFN-NAC处理GBM细胞,发现肿瘤细胞形态和增殖活性均受到抑制。在免疫印迹实验(Western blot)中,SFN-NAC下调肿瘤细胞α-tubulin表达。在激光扫描共聚焦显微镜实验中,可看到SFN-NAC促使肿瘤细胞微管结构紊乱。这些结果表明:SFN-NAC破坏微管,抑制GBM细胞生长。自噬是所有的真核细胞中高度保守的自我维护机制,它通过降解清除细胞内破坏的细胞器,错误折叠的蛋白,长寿蛋白,细胞代谢产生的堆积物等物质,并再次循环利用,以达到细胞自身的健康状态。自噬可分为大自噬(本文如无特别说明皆指大自噬),小自噬,分子伴侣介导的自噬三种模式。微管相关蛋白1轻链3蛋白(LC3)是细胞自噬水平的重要标志。LC3偶联到自噬体上以及胞浆内LC3II/LC3I的比率,已被用来作为自噬水平评价和测定的公认指标。目前发现细胞内调控自噬的通路有多种途径,细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)作为重要的细胞信号转导分子,可以通过调节自噬的相关蛋白而调控细胞自噬水平。本研究发现,在SFN-NAC处理后,GBM细胞中无论ERK1/2磷酸化水平、LC3II/LC3I的比率还是α-tubulin的下调均遵循药物计量反应关系,同时使用ERK1/2通路抑制剂(PD98059)后,SFN-NAC引起的GBM细胞中LC3II/LC3I的比率上调和α-tubulin的下调均得到逆转,接着在GBM细胞转染LC3 siRNA后,SFN-NAC引起的α-tubulin的下调也得到了逆转。为了进一步研究α-tubulin和LC3的关系,本研究使用激光扫描共聚焦显微镜技术和蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)技术,发现SFN-NAC增强了细胞中LC3和α-tubulin的直接结合能力。透射电子显微镜技术也观察到了SFN-NAC处理后的GBM细胞中,出现了标志自噬的超微结构。这些结果表明,在GBM细胞被SFN-NAC处理后,细胞通过激活ERK1/2通路调控细胞自噬水平,进而调控细胞中α-tubulin的表达。自噬在肿瘤治疗过程中扮演着重要角色。不同的细胞和不同的细胞时期中,自噬扮演的功能各不相同。研究发现,一定程度的自噬可以促进肿瘤细胞的发展和转移。而过度的细胞自噬可以导致肿瘤细胞死亡,这也称之为II型细胞程序性死亡。为了进一步研究SFN-NAC引起的自噬与肿瘤细胞侵润和凋亡的关系。本研究使用侵袭实验(Transwell)检测了SFN-NAC抑制肿瘤侵袭的能力,并用自噬选择性抑制剂3-MA抑制细胞自噬,发现联合使用SFN-NAC和3-MA后,GBM细胞的侵润能力较单独使用SFN-NAC下降更加明显。随后,利用Western blot检测了细胞侵润相关蛋白S100A4的表达,证实SFN-NAC引起的细胞自噬促进了S100A4的表达。同样,SFN-NAC诱导的细胞的凋亡水平也在使用3-MA抑制自噬后较单独使用SFN-NAC明显上升。这些结果表明,在GBM细胞中,SFN-NAC引起的细胞自噬促进了细胞侵润,拮抗细胞凋亡。最后,利用中国脑胶质瘤基因组(CGGA)数据库和美国癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库,分析预测了TUBA1B在胶质瘤患者中与肿瘤级别和临床预后的关系,并发现TUBA1B基因作为胶质瘤患者的独立预后因素而存在。这些结果验证了TUBA1B是胶质瘤患者的癌基因之一。综上所述,本研究通过胶质瘤患者数据库筛选出胶质瘤癌基因TUBA1B,并且阐明了SFN-NAC下调GBM细胞α-tubulin蛋白的具体机制和自噬在细胞侵润和凋亡中的作用。这作为SFN-NAC药物抗GBM肿瘤的相关机制研究,为指导SFN-NAC日后的临床应用提供理论支持。第一部分N-乙酰半胱氨酸萝卜硫素通过自噬调节胶质母细胞瘤U87MG和U373MG细胞中α-tubulin表达水平目的:胶质母细胞瘤是神经系统中最常见的极差预后的原发性脑肿瘤,标准的临床治疗方案包括手术切除、化学联合放射疗法。在手术切除肿瘤后,化学药物治疗是最主要的方法,作为目前胶质瘤化疗唯一常用的化疗药物替莫唑胺(temozolomide,TMZ),因肿瘤经常出现对其耐药性,导致胶质瘤患者的生存期极短。因此,急需寻找一种新的高效低毒的化疗替代药物。流行病学调查发现,日常十字花科类植物的食入,可有效降低癌症的发病率,进一步研究发现其天然提取成分SFN是目前人类在自然界中发现的有效抗癌物。结果表明SFN通过破坏微管抑制胶质母细胞瘤细胞生长,N-乙酰半胱氨酸萝卜硫素是SFN衍生物,也是SFN在人体内的代谢产物,具有更长的半衰期和更好通过血脑屏障(BBB)的能力,可能会更有效的抑制肿瘤生长。本实验将研究SFN-NAC抑制胶质母细胞瘤U87MG和U377MG细胞生长的机制和自噬在其中的扮演的作用角色。为日后的临床应用提供基础理论支持。方法:利用细胞增殖活性实验(MTT)检测SFN-NAC抑制胶质母细胞瘤细胞能力;利用倒置显微镜观察细胞形态学变化;利用免疫印迹实验(Western blot)检测细胞内蛋白α-tubulin、LC3II/LCI比率和ERK磷酸化水平;利用免疫共沉淀实验(Co-IP)及免疫荧光细胞化学实验(Confocal)检测LC3与α-tubulin结合能力;利用siRNA沉默技术敲低LC3表达。利用透射电子显微镜技术(TEM)观察细胞内自噬体,自噬溶酶体等细胞超微结构。结果:SFN-NAC抑制胶质母细胞瘤U87MG和U373MG细胞增殖活性遵循剂量依赖关系;SFN-NAC改变U87MG和U373MG细胞形态遵循剂量依赖关系;SFN-NAC处理浓度为30μmol/L时,U87MG和U373MG细胞无论形态还是细胞活力,皆出现明显改变,因此本研究选取30μmol/L为后续实验研究浓度;Western blot显示SFN-NAC下调α-tubulin,上调LC3II/LCI比率同时激活ERK磷酸化水平遵循剂量依赖关系;利用ERK通路抑制剂(PD98059)后,这些结果被逆转;利用LC3 siRNA转染肿瘤细胞后,SFN-NAC引起的肿瘤细胞α-tubulin下调被逆转;Co-IP及Confocal结果显示SFN-NAC增强LC3II与α-tubulin的结合能力。电镜结果显示,SFN-NAC增加细胞内自噬体,自噬溶酶体的形成。第二部分N-乙酰半胱氨酸萝卜硫素诱导的细胞自噬调节胶质母细胞瘤U87MG和U373MG细胞侵润和凋亡目的:胶质母细胞瘤作为恶性程度最高的脑肿瘤,具有极强的侵袭能力和极高的生长速率。控制细胞侵袭和诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略。自噬作为细胞本身高度保守的自我降解代谢机制,在肿瘤的治疗中扮有重要角色。研究显示:在肿瘤治疗过程中,自噬可促进肿瘤耐药性增加,拮抗凋亡,促进肿瘤细胞存活;自噬也可通过调控细胞上皮-间充质转化促进侵润;另一方面,过度的自噬可导致细胞自噬性程序死亡,也称Ⅱ型程序性死亡。前期结果显示,SFN及其部分衍生物可抑制胶质母细胞瘤侵润,促进细胞凋亡。本实验将研究自噬在SFN-NAC抑制胶质母细胞瘤U87MG和U373MG细胞中与肿瘤侵润和凋亡的关系,为在临床上应用SFN-NAC治疗胶质母细胞瘤患者提供理论支持。方法:利用侵袭实验(Transwell)检测SFN-NAC抑制胶质瘤细胞侵袭能力;利用流式细胞术检测SFN-NAC诱导凋亡能力。利用免疫印迹实验(Western blot)检测细胞内蛋白S100A4表达;利用siRNA沉默技术敲低LC3表达。利用自噬选择性抑制剂3-MA抑制肿瘤细胞自噬。利用透射电子显微镜技术(TEM)观察细胞超微结构。结果:侵袭实验结果显示:SFN-NAC(15μmol/L)抑制了U87MG和U373MG细胞侵润能力,3-MA(2.5mmol/L)不改变肿瘤细胞侵润能力。联合使用SFN-NAC和3-MA后肿瘤细胞侵润能力较单用SFN-NAC下降。通过Western blot检测发现:SFN-NAC实验浓度为30μmol/L时,SFN-NAC诱导肿瘤细胞LC3II/LC3I比率上升、上调S100A4表达,利用LC3 siRNA转染肿瘤细胞后,SFN-NAC引起的肿瘤细胞S100A4表达上调被逆转。凋亡实验结果显示:SFN-NAC诱导胶质母细胞瘤凋亡并遵循剂量依赖关系。透射电镜下可见细胞出现核固缩,核碎裂等凋亡特征现象。在SFN-NAC联合加入3-MA处理肿瘤细胞后,细胞凋亡水平较单用SFN-NAC增强。第三部分利用高通量数据分析TUBA1B在胶质瘤患者中的临床意义目的:α-tubulin蛋白在人体内有15种亚型,并被不同的mRNA编码,它们分别是TUBA1A,TUBA1B,TUBA1C,TUBA3D,TUBA3E,TUBA4A,TUBA8等。TUBA1B作为其中之一,高表达于人胶质瘤细胞中。同时,在其它癌症里,发现其与肿瘤分级,预后等临床信息高度相关。为了阐明TUBA1B在胶质瘤中表达与临床意义,本研究利用临床数据进行分析,并对其功能进行预测。方法:分别使用T检验,Kaplan-Meier生存分析和Cox生存分析等数据统计方法评估TUBA1B基因与胶质瘤患者相关临床信息关系。利用GO分析预测TUBA1B基因的功能,对于所有统计学方法,P0.05被认为是有统计学意义。结果:TUBA1B表达量随着胶质瘤级别的增高而增高。生存分析中:高表达TUBA1B的患者的生存周期低于低表达TUBA1B的患者。TUBA1B与患病时的患者年龄,肿瘤分级及IDH突变类型共为患者预后的独立危险因素。TUBA1B与细胞周期关系密切。结论1.SFN-NAC作为天然食物来源的抗肿瘤细胞的小分子物质,具有低毒高效的特点,能够破坏胶质母细胞瘤细胞微管结构从而抑制肿瘤细胞生长。2.SFN-NAC在胶质母细胞瘤细胞中,通过活化ERK1/2,调控细胞自噬,进而下调α-tubulin表达。是SFN-NAC靶向胶质瘤癌基因TUBA1B编译的蛋白α-tubulin治疗胶质瘤的重要机制。3.SFN-NAC引起的细胞自噬促进细胞侵润,拮抗细胞凋亡。
【图文】：

形态图,细胞形态,形态

41图 2 SFN-NAC 改变 U87MG 和 U373MG 细胞形态Fig.2 SFN-NAC induced GBM cell morphological alteration.The (A) U87MG and (B) U373MG cells were examined with Leica DMIRB Microscope at × 200 magnification. Cellstreated with various concentrations of SFN-NAC (0, 10, 20, 30, 40 and 50 μM) generated morphological changes.

自噬,胶质母细胞瘤,细胞

图3 SFN-NAC诱导胶质母细胞瘤细胞自噬Fig.3 SFN-NAC induced autophagy in GBM cellsAutophagosomes and autophogelysomes were observed via transmissionelectron microscopy. Arrows indicate autophagosomes or autolysosomes, solidarrow indicates autophagosome and dotted arrow indicates autolysosome.Scale bar: (A-B, D-E: 1μm), (C, F: 0.5μm).
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41;R730.2

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