HIF-1α调节自噬在缺氧缺血性脑损伤中的作用机制研究
发布时间：2020-06-17 12:56
【摘要】：研究背景新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是造成新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一。HIBD后神经系统受损最为严重,往往遗留诸多后遗症,如脑性瘫痪、智力低下及癫痫等。对孩子、家庭和社会产生了巨大的影响。另一方面,伴随着围产医学的迅速发展,HIBD的病死率逐年下降,但致残率却呈上升趋势。因此,早期、有效的治疗HIBD,对于降低患儿残障率,提高人口素质,有着至关重要的作用。目前,对于HIBD的临床治疗仅局限于在一定程度上缓解症状,其神经系统后遗症的发生率仍居高不下,因此,深入探讨HIBD后的神经元损伤/保护机制,为治疗HIBD寻找新的突破口具有重要的意义。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-l alpha,HIF-1 α)是低氧环境下细胞内一种重要的转录调控因子。正常生理条件下,细胞内不断合成的HIF-1 α可通过泛素-蛋白酶途径降解。当细胞受到低氧刺激时,HIF-]α的降解受到抑制,在胞内大量聚集,通过调控其靶基因的表达从而维持细胞的能量代谢。自噬是一种广泛存在于真核细胞中特有的生命现象,其本质是细胞内利用溶酶体对自身受损的细胞器或者生物大分子物质进行降解和再利用的过程。在饥饿状态下,自噬可分解胞内没用的细胞器,从而为细胞生存提供氨基酸和小分子物质,维持正常的细胞代谢。所以自噬是细胞维持正常代谢平衡和内环境的稳定的重要途径。近年来研究表明,自噬能够维持细胞本身的新陈代谢,除此之外,自噬在人体许多其他疾病的发生和发展过程中发挥着重要的作用,如癌症等。自噬从酵母到哺乳动物在进化上表现高度保守性。Beclin 1是酵母自噬相关基因在哺乳动物中的同源基因,是自噬的直接执行者,参与自噬泡的形成,其表达量越高说明细胞的自噬活性越强。微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)位于自噬泡的膜表面。自噬泡形成的数量与LC3的含量呈正比。因此,Beclin 1和LC3的表达量可以用来衡量细胞自噬的程度。近年来研究认为,低氧诱导的自噬与HIF-1 α的异常表达有关。低氧环境中,细胞中聚集的HIF-1α能促进BCL2/腺病毒E1B相关蛋白3(BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3,BNIP3)的转录和蛋白表达。而BNIP3可以与Beclin 1竞争结合bcl-2,造成大量游离的Beclin 1,从而激活细胞自噬。因此,上调的HIF-1a可通过加强其靶基因BNIP3的表达,激活自噬。目前国内外主要是在肿瘤细胞中进行HIF-1 α与自噬关系的研究,而HIBD时神经元的自噬是否也存在相同的作用机制需要进一步研究。本研究拟通过体内外实验阐明缺氧缺血中自噬对脑损伤的影响,以及HIF-1α对神经元自噬的调节机制,为HIBD的预防和治疗提供理论依据。目的1.探索氧糖剥夺后皮层神经元细胞中的自噬程度,及其对细胞生存率和死亡率的影响。2.探讨氧糖剥夺后皮层神经元细胞中HIF-1α的表达状况,并分析皮层神经元细胞中HIF-1 α的表达与自噬的相关性。3.细胞实验验证氧糖剥夺后,HIF-1α是否通过HIF-1α/BNIP3/Beclinl信号通路调控皮层神经元细胞的自噬。4.动物实验探索自噬在缺氧缺血性脑损伤中的作用及相关机制,为临床治疗提供新的途径。方法1.分离培养新生24 h内的SD大鼠皮层神经元,皮层神经元细胞的培养使用DMEM培养液,在培养箱中进行,温度控制在37℃,体积分数为5%CO2、湿度控制在饱和状态。采用神经元特异性烯醇化酶对神经元进行鉴定。2.选取体外培养5d的神经元细胞,使用氧糖剥夺法,制作细胞缺氧模型。具体操作如下:替换培养基,使用预先以无氧混合气体填充30min的无糖DMEM培养液,随后将细胞置于无氧混合气体填充的容器中,37℃,饱和湿度条件下培养 1.5h。在氧糖剥夺后 Oh、6h、12h、24h 和 48h,用 Annexin V-FITC/PI双染色法测定神经元细胞凋亡率,MTT法测定神经元存活率,Western blot法测定皮层神经元的HIF-1α、BNIP3、自噬相关蛋白LC3和Beclin 1表达量。在氧糖剥夺后Oh、12h,MDC荧光染色、激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜观察细胞自噬的变化。3.分别用HIF-1α的抑制剂ME2、自噬抑制剂3-MA、自噬促进剂Rapa预处理皮层神经元细胞 30 min,HIF-Iα siRNA、BNIP3 siRNA、Beclin 1 siRNA转染皮层神经元细胞,氧糖剥夺Oh、12h后Annexin V-FITC/PI双染色法测定神经元细胞凋亡率,MTT法测定神经元存活率,Western blot法测定皮层神经元细胞BNIP3、Beclin 1、HIF-1α、自噬蛋白LC3表达量。4.将60只7日龄的SD大鼠按窝别、体重配对后随机分为2组(Sham组、HIBD组),每组30只。每组分别于造模后6h、12h、24h、48h、72h处死,qRT-PCR、Western blot 检测 HIF-1 α mRNA、BNIP3 mRNA、Beclin 1 mRNA 及其蛋白水平的表达变化。5.将54只7日龄的SD大鼠按窝别、体重配对后随机分为3组(Sham组,HIBD 组,HIBD+3-MA 组),依据实验一的 qRT-PCR、Western blot 结果,三组均在造模后24h处死取脑,免疫荧光双标染色进行细胞定位、Western blot检测自噬蛋白LC3表达变化、干湿重法测量脑水肿、TUNEL荧光染色检测凋亡率。结果1.原代皮层神经元大多数在数小时内开始贴壁,呈圆形或椭圆型,体积小,立体感强。培养第2天,几乎所有细胞会长出一个突起,胞体增大,呈圆形或椭圆形,光晕明显。培养第3天细胞继续增大,突起延长。培养第5天时神经元胞体明显增大,呈圆形、椭圆或者锥体形,细胞以双极型、三极型多见,偶见单极型。2.在体外氧糖剥夺模型中,随着时间延长,皮层神经元细胞死亡率逐渐增加,存活率逐渐下降;且HIF-1α表达量逐渐增加,抑制HIF-1α表达,可以降低皮层神经元细胞的死亡,提高细胞的存活率。3.在体外氧糖剥夺模型中,随着时间逐渐增加,LC3的表达量逐渐增加。氧糖剥夺12h时,激光共聚焦显微镜观察到细胞内出现大量绿色亮点,透射电子显微镜发现有大量的双层囊泡形成,并且MDC标记细胞阳性细胞率明显增加。4.氧糖剥夺模型下,自噬抑制剂3-MA可以提高皮层神经元细胞存活率。在自噬促进剂Rapa作用下,皮层神经元细胞存活率显著降低。5.氧糖剥夺模型下,阻断Beclin1的表达可增加皮层神经元细胞存活率,降低死亡率。6.体内大鼠HIBD模型中,缺血区皮层神经元细胞的自噬及凋亡增加,脑组织水肿明显。自噬抑制剂3-MA能减轻缺血区神经元的自噬及凋亡,改善脑组织水肿。结论1.脑缺氧缺血环境诱导皮层神经元细胞自噬途径启动,导致皮层神经元细胞死亡。2.氧糖剥夺后,皮层神经元细胞中HIF-1α表达上调,并可能通过HIF-1α/BNIP3/Beclin1信号通路启动自噬途径,导致了细胞死亡效应,并进一步加重了神经功能损伤。3.干扰自噬途径,可以抑制皮层神经元细胞的死亡效应,为HIBD的治疗提供了新的靶点。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
【图文】：
在倒置显微镜下对原代皮层神经元细胞在体外培养条件下的形态学特征进逡逑行观察。在离体后的数小时内，大多数神经元开始贴壁，形态为为圆形或椭圆逡逑型，体积小，立体感强。见图１．１。体外培养４８ｈ后，细胞会形成一个突起，胞逡逑体明显增大，细胞呈圆形或椭圆形，光晕明显（图１．２）。随着体外培养时间延逡逑长，细胞继续增大，突起延长。见图１．３邋（体外培养７２ｈ）。体外培养至第５天逡逑时神经元胞体明显增大，呈圆形、椭圆或者锥体形，细胞以双极型、三极型多逡逑见，偶见单极型。细胞突起变粗变长且有分支，边缘清晰l柧缫丫帷ｅ义洗耸鄙窬赴陌迩逦髁粒忻飨酝黄穑褐氏赴虺杀馄阶矗廾麇义舷怨嬖颉＜迹保础？汕稚窬头巧窬ｅ义希义贤迹保备战又值钠げ闵窬ǎ矗埃逋迹保才嘌矗福璧钠げ闵窬ǎ矗埃╁义希浮义贤钾撑嘌罚玻璧钠げ闵窬ǎ矗埃╁逋迹保磁嘌冢
本文编号：2717635
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
【图文】：
在倒置显微镜下对原代皮层神经元细胞在体外培养条件下的形态学特征进逡逑行观察。在离体后的数小时内，大多数神经元开始贴壁，形态为为圆形或椭圆逡逑型，体积小，立体感强。见图１．１。体外培养４８ｈ后，细胞会形成一个突起，胞逡逑体明显增大，细胞呈圆形或椭圆形，光晕明显（图１．２）。随着体外培养时间延逡逑长，细胞继续增大，突起延长。见图１．３邋（体外培养７２ｈ）。体外培养至第５天逡逑时神经元胞体明显增大，呈圆形、椭圆或者锥体形，细胞以双极型、三极型多逡逑见，偶见单极型。细胞突起变粗变长且有分支，边缘清晰l柧缫丫帷ｅ义洗耸鄙窬赴陌迩逦髁粒忻飨酝黄穑褐氏赴虺杀馄阶矗廾麇义舷怨嬖颉＜迹保础？汕稚窬头巧窬ｅ义希义贤迹保备战又值钠げ闵窬ǎ矗埃逋迹保才嘌矗福璧钠げ闵窬ǎ矗埃╁义希浮义贤钾撑嘌罚玻璧钠げ闵窬ǎ矗埃╁逋迹保磁嘌冢
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