中国汉族人烟雾病的HLA风险区域关联研究及HDAC9基因多态性的研究

发布时间：2020-06-18 22:18

【摘要】：研究背景烟雾病(Moyamoya disease,MMD)是一种进行性闭塞性脑血管结构异常的脑血管疾病。其特征是颈内动脉颅内段及其近端分支的进行性狭窄或闭塞,随后形成异常的侧支血管。作为儿童卒中和青年卒中的主要原因之一,虽然烟雾病的研究在过去取得了很大的进展,但其病因和发病机制仍是未知的。本研究团队前期进行了关于中国汉族人种烟雾病的2阶段全基因组关联分析研究(Genome-Wide Association Study,GWAS),组织富集分析显示相关基因座的基因在免疫系统中高度表达。这些结果提示中国汉族人种烟雾病可能与免疫相关。众所周知,人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)在免疫系统中具有重要的作用,但HLA区域与中国汉族人种烟雾病之间的相关研究目前研究较少。此外,前期研究也在组蛋白去乙酰化酶9(Histone deacetylase 9,HDAC9)区域发现了一个显著相关的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP),rs2107595,既往研究发现HDAC9区域与大血管疾病相关,结合以上研究结果,我们假设中国汉族人种烟雾病可能与免疫相关,可能与大血管疾病存在一些共同的发病机制。研究目的为进一步验证假设,拟分别通过研究一即对中国汉族人种烟雾病患者及健康对照组的HLA区域进行遗传学分析,研究二即大血管卒中风险基因HDAC9在烟雾病患者中进行验证,为进一步的探讨中国汉族人种烟雾病的发病机制提供遗传学依据。此外,我们也拟进行研究三即利用烟雾病的危险因素同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)处理原代培养脑血管平滑肌细胞,探讨HDAC9在脑血管平滑肌中的作用,进一步探讨HDAC9在烟雾病中可能的作用。研究方法研究一:(1)对755例烟雾病患者及2031例对照利用Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片进行全基因组分型,并提取HLA区域的基因分型位点。(2)对所获取的HLA区域中数据的SNPs、经典等位基因和相应的氨基酸多态性利用SNP2HLA基因填补(Imputation)的方法进行填充。(3)利用逐步回归分析的方法,发现烟雾病在HLA区域内的独立信号并进行相关的分析;研究二:(1)使用Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片对755例烟雾病患者及2031例对照进行全基因组范围基因分型,整理HDAC9区域的基因分型位点。(2)将755例烟雾病患者及2031例对照的HDAC9的基因分型数据利用Plink1.07软件进行趋势卡方检验,以获取两组之间存在统计学的差异的等位基因频率;研究三:(1)利用CCK-8实验观察在不同浓度Hcy处理24小时和48小时后,脑血管平滑肌细胞增殖的情况。(2)利用细胞划痕实验观察500μM Hcy处理48小时对脑血管平滑肌细胞的迁移功能的影响。(3)利用RT-PCR和Western-blot的实验方法检测上述处理后脑血管平滑肌细胞的HDAC9表达量的变化。(4)构建HDAC9 shRNA并处理脑血管平滑肌细胞,分别用RT-PCR和Western Blot检测细胞HDAC9表达量的变化。(5)HDAC9 shRNA处理脑血管平滑肌细胞,利用CCK-8和细胞划痕实验分别观察在500μM Hcy处理下细胞增殖和迁移的变化。研究结果研究一:通过SNP2HLA进行Imputation,共获得24862个SNP,178个经典HLA等位基因及688个氨基酸位点。其中P值最显著的SNP为rs3129731(P=3.69×10~(-16),OR=1.79)。关联最强的经典等位基因为HLA-B*46(P=4.12×10~(-11),OR=0.49),关联最强的氨基酸多态性为HLA-B分子第24位丙氨酸残基(Ala,A,P=3.48×10~(-14),OR=1.58)。通过逐步回归分析,我们发现了rs3129731(P=3.69×10~(-16),OR=1.79),rs1071817(P=1.26×10~(-11),OR=0.62)2个独立信号。将SNP置入eQTL数据库进行查询,发现rs3129731与HLA-DQA2基因的表达有关;研究二:通过从烟雾病的外周血全基因组数据中提取7p21内HDAC9区域的GWAS数据,共获得了321个SNP。显著相关的SNP有114个。其中rs2107595(P=1.40×10~(-14),OR=1.69),rs2389995(P=0.03,OR=1.16)在烟雾病病例与对照间存在显著性差异;研究三:原代培养脑血管平滑肌细胞增殖功能均随着Hcy处理的浓度增加而增强,且处理48小时后,浓度为500μM Hcy处理的脑血管平滑肌细胞增殖最显著;500μM Hcy处理脑血管平滑肌细胞48小时后,与对照组相比,其的迁移显著加快且细胞内HDAC9的表达水平显著增加;我们构建了HDAC9 shRNA用于干扰脑血管平滑肌细胞HDAC9的表达,结果发现HDAC9 shRNA可以显著的降低脑血管平滑肌细胞内HDAC9 mRNA和HDAC9蛋白的表达;500μM Hcy处理48小时后,与对照组相比,HDAC9 shRNA处理组的脑血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力显著降低。研究结论本课题首先通过Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片对768例烟雾病患者及2041例对照进行全基因组分型,然后对HLA区域进行Imputation及相关分析,发现了2个中国汉族人群的HLA区域的独立信号,证明了HLA区域在烟雾病发病中的重要作用,说明中国汉族人种烟雾病与免疫相关;然后在HDAC9基因区域发现了既往报道的与大血管卒中相关的位点,提示烟雾病可能与大血管卒中存在可能的共同的致病机制,且HDAC9参与其中;最后通过利用烟雾病的危险因素同型半胱氨酸处理原代培养脑血管平滑肌细胞,研究HDAC9在脑血管平滑肌细胞中的作用,结果显示HDAC9在维持脑血管平滑肌细胞功能具有重要作用。通过以上的研究阐释了在中国汉族人种烟雾病与免疫相关,此外可能与大血管卒中存在可能的共同的致病机制,而这一致病机制中HDAC9可能参与其中。以上结果阐述了烟雾病的部分发病机制,为烟雾病的进一步研究提供了新方向和理论依据。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743
【图文】：

主成分,烟雾病,分型,全基因组

安徽医科大学博士学位论文果全基因组 SNP 分型数据统计结果由于异常的杂合性＞平均值±3SD 或基因分型检出率＜98%排除 1 例烟和 3 例健康对照。然后我们使用 PLINK 1.07 软件中的 IBD 分析检查了病组的潜在遗传相关性。对检测到的所有同卵双胞胎、第一、第二相对样率较低的 3 例烟雾病病例进行剔除。采用主成分分析法（PCA）发现有病病例和 7 例健康对照为离群值，这些被剔除。最终共有 755 例烟雾病031 例健康对照样本纳入研究。结合 Hap Map 样本分型数据，对 755 例烟雾病病例和 2031 例健康对照分利用 PCA 分析方法分析匹配的情况，结果如图 1 所示，两组样本间基本异常的偏离样本。此外对两组 747089 个全基因组范围内的常染色体 SN分析，结果发现两组样本匹配良好（λgc 为 1.04）。

等位基因,优势比,关联分析,置信区间

susceptibilityChr Varients A1/A2Frequency of A1P OR（95% CI）Cases ControlHLA allele6 HLA-B*46 P/A 0.07 0.14 4.12×10-110.49（0.40-0.61）Amino acid polymorphism6 HLA-B amino acid Ala 24 A/P 0.57 0.45 3.48×10-141.58（1.41-1.78）SNPs6 rs3129731 T/G 0.26 0.17 3.69×10-161.79（1.554-2.061）Chr 为染色体号；A1/A2 分别是：A1：最小等位基因， A2：最大等位基因，其中 A/P 中，P 代表存在，A 代表不存在；P 为 logistic 关联分析的 P 值；OR 为优势比，95% CI 为 95%的置信区间（Confidence interval, CI）。

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