Sema7A在癫痫中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-19 16:05

【摘要】：第一部分:Sema7A在颞叶癫痫患者及戊四氮癫痫模型大鼠脑组织中的表达研究目的:主要检测Sema7A在颞叶癫痫患者脑组织标本以及戊四氮点燃癫痫模型大鼠脑组织标本中的表达情况。方法:1.从临床收取的诊断为难治性颞叶癫痫患者术后切除脑组织中按照随机抽取原则选取16例标本作为人癫痫组脑组织,同时选取12例不伴有癫痫病史的颅脑外伤患者术后颞叶脑组织标本作为人对照颞叶脑组织。2.选取成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,随机分为生理盐水对照组和戊四氮慢性点燃癫痫造模组,其中被点燃成功的SD大鼠被选取作为癫痫组。3.使用免疫印迹技术、免疫组织化学、免疫荧光技术检测Sema7A在颞叶癫痫患者及戊四氮慢性癫痫模型大鼠脑组织中的表达变化。结果:1.Sema7A在颞叶癫痫患者脑组织中和慢性癫痫模型大鼠脑组织中均有较丰富的表达,且主要表达在神经元细胞的胞浆和胞膜中。2.在人颞叶癫痫脑组织中,Sema7A的表达水平明显高于非癫痫对照组(p0.05)。3.在戊四氮慢性点燃癫痫大鼠模型的海马及颞叶脑组织中,点燃组的Sema7A表达水平均明显高于生理盐水对照组(p0.05)。结论:Sema7A丰富表达于人及大鼠颞叶和海马脑组织的神经元细胞胞浆和胞膜中。颞叶癫痫患者及慢性癫痫大鼠脑组织中,Sema7A的表达水平较对照组相比均明显增高,提示Sema7A可能在癫痫的发生发展中有一定的相关性,发挥了一定的作用。第二部分Sema7A在癫痫中的作用研究目的:通过颅内转染慢病毒载体干扰抑制和过表达Sema7A,检测慢病毒载体的作用效率及稳定性;观察慢病毒干扰抑制或过表达Sema7A后,慢性癫痫大鼠行为学的变化;观察Sema7A作为轴突导向分子,对慢性癫痫大鼠海马中主要轴突苔藓纤维投射出芽的影响。方法:1.分别构建含有Sema7A-RNAi序列的干预慢病毒载体(Lentiviral vector,LV)和含有Sema7A过表达基因片段的慢病毒载体,通过颅内定位注射的方法转染到SD大鼠海马DG(Dentate Gyrus)区的神经元细胞,分别干预抑制和过表达大鼠海马区的Sema7A表达水平。通过免疫印迹技术、免疫荧光来分别验证Sema7A是否转染成功,转染的效率及稳定性。2.选取雄性SD成年大鼠,随机分组为癫痫干预对照组(Con-RNAi)、癫痫干预组(Sema7A-RNAi)、癫痫过表达对照组(Con-Sema7A)、癫痫过表达组(Sema7A),分别用相应慢病毒进行大鼠海马DG区定位注射。3.注射病毒后,每日腹腔注射戊四氮(35mg/kg)构建慢性点燃癫痫大鼠模型,观察统计造模过程中癫痫大鼠的行为学改变,包括出现第一次4或5级癫痫发作的潜伏期,4和5级癫痫发作的总的持续时间,4或5级癫痫发作的发作次数。4.注射干预和过表达病毒的戊四氮点燃癫痫大鼠模型后,再次给予颅内DG区定位注射生物素标记地葡糖聚胺(Biotindextran amine,BDA)进行顺性轴突示踪,观察海马苔藓样纤维生长投射受不同水平Sema7A的影响。结果:1.转染干预和过表达慢病毒载体后,通过免疫荧光结果可见慢病毒载体成功转染了大鼠海马DG区的神经元细胞;免疫印迹实验结果提示,注射Sema7A-RNAi抑制慢病毒载体后14天和42天,Sema7A的表达水平与Con-RNAi对照组相比明显下降,注射Sema7A过表达慢病毒载体后14天和42天,Sema7A的表达水平与Con-Sema7A对照组相比明显增高(p0.05)。2.在戊四氮慢性点燃癫痫大鼠模型中,下调Sema7A的表达水平可以使第一次4或5级癫痫发作的潜伏期明显延长,使4和5级癫痫发作的总的持续时间明显减少,4和5级癫痫发作的发作次数明显减少;而过表达Sema7A可以使第一次4或5级癫痫发作的潜伏期明显缩短,使4和5级癫痫发作的总的持续时间明显延长,4和5级癫痫发作的发作次数明显增多(p0.05)。3.敲低癫痫大鼠海马DG区的Sema7A表达水平,可以使海马区苔藓纤维从门区向CA3区的投射数量明显减少;过表达癫痫大鼠海马DG区的Sema7A表达,可以使海马区苔藓纤维从门区向CA3区的异常生长,投射数量明显增多,且向外层发芽(p0.05)。结论:1.Sema7A-RNAi和Sema7A慢病毒载体均可以成功敲低和过表达SD大鼠海马DG区Sema7A的表达水平;2.敲低Sema7A水平可以降低大鼠癫痫发作的易感性,相反过表达Sema7A水平可以提高大鼠癫痫发作的易感性,Sema7A可以促进癫痫发作。3.在癫痫大鼠中,Sema7A可以影响苔藓纤维生长,促进苔藓纤维从门区向CA3区异常生长投射并发芽。第三部分Sema7A在癫痫中的作用机制目的:过去研究认为Sema7A可以通过MAPK通路在中枢神经系统中发挥作用。因此我们认为在癫痫中Sema7A可能也通过MAPK通路来发挥作用,调节癫痫的易感性。本部分主要探讨Sema7A是否通过ERK通路调节癫痫大鼠海马脑组织中的炎症反应及轴突苔藓纤维生长。方法:1.选取雄性SD成年大鼠,随机分组为癫痫干预对照组(Con-RNAi)、癫痫干预组(Sema7A-RNAi)、癫痫过表达对照组(Con-Sema7A)、癫痫过表达组(Sema7A),分别用相应慢病毒进行大鼠海马DG区定位注射。2.使用免疫印迹方法检测在过表达和敲低戊四氮癫痫大鼠海马DG区的Sema7A表达水平后,下游通路ERK1/2磷酸化水平,以及下游炎症因子白介素6(interleukin-6,IL-6),肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)在不同组之间的表达变化。5.将Sema7A过表达慢病毒定位注射在大鼠海马DG区,将过表达Sema7A组和过表达对照组的癫痫大鼠给予每日腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制剂U0126(30mg/kg)抑制ERK1/2磷酸化水平,观察统计造模过程中癫痫大鼠的行为学改变,包括出现第一次4或5级癫痫发作的潜伏期,4和5级癫痫发作的总的持续时间,4或5级癫痫发作的发作次数。6.检测给予U0126抑制ERK1/2磷酸化水平后,Sema7A过表达组和过表达对照组下游炎症因子IL-6,TNF-α在不同组之间的表达变化。7.检测给予U0126抑制ERK1/2磷酸化水平后,Sema7A过表达组和过表达对照组给予颅内DG区定位注射生物素葡糖聚胺(Biotindextran amine,BDA)进行顺性轴突示踪,观察海马苔藓样纤维生长投射受不同水平Sema7A的影响。结果:1.在戊四氮慢性点燃癫痫大鼠模型中,敲低Sema7A可以使ERK1/2的磷酸化水平,而过表达Sema7A则可以使ERK1/2的磷酸化水平明显上调(p0.05)。说明Sema7A的表达水平和ERK1/2的磷酸化水平正性相关。2.敲低Sema7A可以使癫痫大鼠海马脑组织中的炎性因子IL-6,TNF-α水平明显降低,而过表达Sema7A则可以使IL-6,TNF-α水平明显增高(p0.05)。3.给予U0126抑制剂明显地降低了癫痫大鼠过表达Sema7A对ERK1/2磷酸化水平的上调作用(p0.05)。4.抑制剂U0126明显抑制了癫痫大鼠过表达Sema7A对炎症因子IL-6和TNF-α的正性上调作用,使两种炎性因子的表达水平较过表达组明显降低(p0.05)。5.过表达Sema7A的癫痫大鼠给予抑制剂U0126后,通过BDA神经示踪发现,该组的苔藓纤维生长较过表达组明显减少,从大鼠海马门区向CA3区投射的苔藓纤维数量变少(p0.05)。结论:1.在癫痫大鼠脑组织中,上调或下调Sema7A可以引起ERK1/2磷酸化水平,炎症因子IL-6,TNF-α的水平改变,提示Sema7A可能通过ERK1/2通路实现对癫痫中炎症反应的调控。2.U0126可以抑制EKR1/2磷酸化水平,抑制Sema7A对癫痫大鼠行为学的影响,以及对IL-6及TNF-α水平的上调作用。同时U0126可以抑制Sema7A对癫痫大鼠海马苔藓纤维的生长。提示在癫痫大鼠中,Sema7A影响神经炎症反应及苔藓纤维生长的作用机制是通过对ERK磷酸化通路调控来实现的。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.1
【图文】：

患者,对照组,免疫荧光,绿色

35图 1-1. Sema7A 在 TLE 患者和对照组患者中的表达分析Fig1-1. Sema7A expression in TLE patients and nonepileptic patients.（a）Sema7A 在 TLE 患者和对照组患者中的免疫荧光代表图。Sema7A（绿色）和 NSE（红

示意图,大鼠,电极植入,发作期

图 1-2. PTZ 点燃模型大鼠的 LFP 验证。Fig1-2. LFP recordings from rats after PTZ kindling.验过程的示意图。给予点燃大鼠最后一次 PTZ 注射后将电极植入背侧海马P。（b）来自成功点燃的大鼠代表性的 LFP 脑电记录图（基线，发作间期和期和发作期均检测到癫痫波，证明 PTZ 模型成功。ematic diagram of the experimental design. The electrodes were implantedhippocampus after the last PTZ injection, and then the LFP was recontative LFP recording from a successfully kindled rat. The baseline, intericta were recorded. Seizure spikes were detected in both the interictal and ictaeans that the PTZ models are successful.

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