远隔缺血预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用及免疫机制

发布时间：2020-06-19 23:24

【摘要】：背景:脑卒中已成为危害人类健康及生存质量的主要杀手。在中国,脑卒中已成为全疾病顺位死亡原因的首位。缺血性脑卒中占全部脑卒中的80%以上,具有高患病率、高致残率、高死亡率及高复发率的四高特征。脑卒中是一个可防、可控的疾病。除了对原发疾病控制外,还需要对卒中发生及发展给与有效防控措施。远隔预处理作为一种新兴的缺血/再灌注损伤的保护手段,引起了神经科学的重视。本研究旨在证实远隔缺血预处理(Remote Ischemic preconditioning,RIPrC)对神经系统缺血/再灌注损伤的保护作用,并在此基础之上,系统研究和分析其神经保护作用机制。缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)也称缺血预适应,是指通过一次或多次短暂性、亚致死性的缺血/再灌注,诱导启动组织或细胞内源性保护机制,从而提高组织对致死性缺血损伤耐受力,降低损伤程度,减少损伤范围。远隔缺血预处理是指利用一个器官或组织的短暂缺血/再灌注可以通过在循环中释放生化信使或激活神经通路而对远隔器官的缺血性损伤产生保护作用。RIPrC对受保护的靶器官无创伤且不产生直接应激,因此具有广阔的临床应用前景。RIPrC的确切作用机制目前尚不清楚,研究认为直接缺血预处理时保护信息在同一器官中传递,而RIPrC时将保护信息传递到远隔器官。信息的传递可能通过体液介质、神经通路或联合作用介导。我们部分前期工作发现在脑梗死患病后,经过远隔缺血后处理后,外周的血液内一些炎症细胞及炎症因子有不同程度的变化,这些变化伴随着患者的神经功能的改善,对中枢神经系统的缺血/再灌注损伤起到保护作用。因此我们推测,远端缺血处理可能通过影响机体免疫功能作用于中枢。目的:证实RIPrC对小鼠MCAO模型的缺血及再灌注脑损伤的保护作用;RIPrC对正常小鼠外周和中枢神经系统免疫功能的影响;通过RIPrC对脑缺血及再灌注损伤后中枢及外周免疫功能的调控,探索出免疫调控相关的细胞信号传导通路,最终探索出RIPrC通过影响中枢及外周免疫功能达到保护作用。方法:实验动物采用8-10周龄的成年健康雄性C57/BL6小鼠,体重20-25g;RIPrC采用左下肢血流阻断15min后血液复流15min为一个周期,共实施3个周期,24小时后实施MCAO;线栓法制作小鼠MCAO模型;激光多普勒血流仪监测下肢血流是否阻断及测定MCAO后脑血流下降程度;TTC染色观察脑梗死体积;Longa评分测定神经功能,角落试验(the corner test)和除胶试验(the adhesive tape removal test)评价行为学;质谱流式细胞术测定外周血免疫细胞及细胞信号转导通路关键因子。结果:(1)MCAO小鼠造模后角落实验转向健侧肢体几率明显增高,去胶带时间明显延长,而在造模前实施了RIPrC,角落试验转向健侧肢体几率明显降低,去胶带时间明显缩短,同时Longa评分也有所好转,脑梗死体积明显缩小,说明RIPrC可明显改善脑缺血后运动神经功能损伤及缩小脑梗死体积。(2)远隔缺血处理后,质谱流式的检测结果为正常小鼠在外周血中,中性粒细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较对照组有所增加,单核细胞、B细胞、Eff/mem CD4+T细胞和Eff/mem CD8+T细胞以及中性粒细胞的变化趋势为先明显减少再增加。在颅内,中性粒细胞、B细胞、Eff/mem CD4+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较对照组有所增加,Eff/mem CD8+T细胞以及小胶质细胞没有明显变化。远隔预处理可使p EGFR、i NOs在CD4+T细胞、Eff/mem CD4+T细胞以及中性粒细胞中的表达减少,而在CD8+T细胞以及Eff/mem CD8+T细胞中表达明显增多。p ERK1-2、p S6、p STAT3、Gata3、IRF4和Arg-1在五种细胞内表达均明显减少。在颅内小胶质细胞中,远隔预处理后p EGFR和Arg-1明显增加,p ERK1-2、p S6、p STAT3、Gata3以及IRF4明显减少。(3)RIPrC后,质谱流式的检测结果为,MCAO小鼠RIPrC激活脑缺血及再灌注损伤后外周的免疫功能,但却抑制了中枢神经系统的免疫反应,表现为在外周血中白细胞总数、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞的数量明显增加,在颅内这些细胞亚群以及小胶质细胞的数量明显降低。CD4+T细胞、Eff/mem CD4+T细胞、CD8+T细胞、Eff/mem CD8+T细胞、中性粒细胞以及小胶质细胞中促炎症相关细胞信号转导通路关键因子p4E-BP1、p STAT4、p STAT1、p STAT3、p-P38、i NOs以及I?Ba在处理后明显降低,Arg-1在CD4+T细胞、Eff/mem CD4+T细胞、CD8+T细胞、Eff/mem CD8+T细胞、中性粒细胞中降低,而在小胶质细胞中则明显升高。结论:(1)RIPrC对小鼠MCAO模型的缺血及再灌注脑损伤具有保护作用;(2)远隔缺血处理可影响正常小鼠外周和中枢神经系统免疫功能,其效应细胞主要为CD4+T细胞、Eff/mem CD4+T细胞、CD8+T细胞、Eff/mem CD8+T细胞、中性粒细胞以及小胶质细胞,可能影响的细胞信号转导通路为p EGFR、i NOs、Arg-1、p ERK1-2、p S6、p STAT3、Gata3以及IRF4;(3)通过RIPrC对脑缺血及再灌注损伤后中枢及外周免疫功能的调控,RIPrC可能通过调节p STAT3、i NOs以及Arg-1信号转导通路调节CD4+T细胞、Eff/mem CD4+T细胞、CD8+T细胞、Eff/mem CD8+T细胞、中性粒细胞以及小胶质细胞的数量以及状态,影响MCAO小鼠的免疫环境,进而对MCAO小鼠发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
【图文】：

示意图,示意图,异氟烷,小鼠

图 2.1 分组示意图Fig2.1 Experimental groups（2）MCAO 模型的建立采用 Longa 线栓法建立 MCAO 模型[62]，具体方法如下：①小鼠称重，5%异氟烷诱导麻醉后，调整异氟烷浓度为 1.5-2%，用呼吸面罩维持麻醉状态；②将小鼠仰卧位固定在解剖手术台上，用含润滑油的眼膏保护小鼠眼睛，用直流电哺乳动物体温控制器控制其体温（直肠温度）在（37.0±0.5)℃，以左侧大脑中动脉为手术侧，颈部备皮，碘伏、75%酒精棉球依次消毒；③行颈部前正中切口，剪开皮肤，分离皮下组织，暴露鼓泡腺并将其推向两侧，钝性分离颈部肌肉筋膜，沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉，暴露颈动脉三角；④显微镊钝性分离颈总动脉（common carotid artery, CCA）、颈内动脉（intemal

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方法9.0.0 进行统计学分析。数据以均数±标准差（）差分析（OneWayANOVA）和非参数 t-test。P<0.05 为价验落试验（thecornertest）评价小鼠感觉运动功能。每只此试验。15 只雄性 C57/BL6 小鼠随机分为 3 组，每；②缺血模型组（MCAO 组）；③远隔预处理组（RIP0 次，记录小鼠左转的次数。

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