α-突触核蛋白病理性C端截短对其聚集性及毒性影响的研究

发布时间：2020-06-30 15:08

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一类主要影响运动系统的神经退行性疾病,在60岁以上人群的患病率高达1%。据统计,2015年全球范围存在约620万名PD患者。PD最主要的病理特征为大脑基底神经节中的多巴胺能神经元死亡以及神经细胞内出现嗜酸性的细胞质包涵体(路易体,Lewy bodies)。路易体是由α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)形成的纤维状聚集物组成的脑部蛋白质淀粉样沉积。α-Syn是一种SNCA基因编码的由140个氨基酸组成蛋白,主要存在于中枢神经系统神经元细胞的突触前末端中,占脑部细胞质总蛋白量的1%左右。天然状态下,α-Syn在溶液中呈现无规则卷曲结构,作为分子伴侣参与SNARE复合物的形成,在神经元高尔基体的运作和囊泡运输中起到重要作用。病理条件下,α-Syn发生错误折叠,分子间相互结合形成毒性聚集中间体,最终形成富含b-折叠结构的线形纤维沉积于脑部。在部分家族性PD病例中发现了几种α-Syn的单氨基酸突变体,如A18T、A29S、A30P、E46K、H50Q、G51D和A53T,这些病理突变体的聚集性与毒性与野生型α-Syn不尽相同,其导致PD发生的机理仍未研究清楚。α-Syn在体内经历一系列翻译后修饰,如磷酸化、硝基化、泛素化、蛋白酶解等。其中,蛋白酶解一般发生在α-Syn的C端,约有10-30%的α-Syn在PD患者脑部的路易体内以C端截短形式出现。神经退行性疾病常伴随有慢性的神经炎症,研究报道神经炎症中的重要调节因子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)可在121位天冬氨酸与122位天冬酰胺之间剪切α-Syn,生成C端19个氨基酸缺失的截短蛋白α-Syn 1-121(α-Syn121)。抑制Caspase-1对α-Syn的剪切能够降低炎症因子诱导的细胞死亡,同时能够缓解多系统萎缩模型小鼠的行为障碍及脑部α-Syn蛋白沉积。因此,Caspase-1以及α-Syn121在PD的发生与发展中可能起到重要作用。此外,研究表明PD患者脑部路易体内出现金属离子(如铜离子)的异常蓄积,铜离子可通过芬顿反应催化氧分子生成活性氧,对细胞和组织造成损伤。α-Syn全长被报道通过络合铜离子抑制活性氧的产生,其结合位点主要位于α-Syn N端1-9氨基酸片段及50位组氨酸。在本论文中,我们对α-Syn及其病理突变体A18T、A29S、A30P、E46K、H50Q、G51D和A53T全长以及相应121截短蛋白的聚集性、膜毒性以及细胞毒性进行了一系列研究。同时我们还研究了α-Syn及其病理突变体全长和相应的121截短蛋白影响铜离子催化活性氧产生的能力。在本论文的第二章,硫黄素T荧光实验、细胞毒性实验以及染料泄漏实验结果表明α-Syn121的聚集速度和细胞毒性较α-Syn全长显著性增强,但破膜能力减弱。透射电子显微镜与傅里叶变换红外光谱的实验结果进一步显示α-Syn121形成以无规则卷曲结构为主的无定型聚集物,而α-Syn全长形成以b折叠结构为主的线形纤维。蛋白质免疫印迹实验与活性氧产生实验结果表明α-Syn121形成的无定型聚集物能够通过激活凋亡通路以及诱导活性氧产生导致细胞死亡。此外通过蛋白质免疫印迹实验与免疫荧光实验,我们观察到外源的α-Syn121聚集物可促使细胞内Caspase-1活化,剪切内源α-Syn生成α-Syn121,促进细胞内α-Syn蛋白的沉积。在本论文的第三章,硫黄素T荧光实验、细胞毒性实验以及染料泄漏实验结果表明,与各种α-Syn病理突变体全长相比,相应的121截短蛋白的聚集性和细胞毒性同样显著性增强,但破膜能力减弱。抗坏血酸盐损耗实验、香豆素3-羧酸氧化实验以及Amplex红氧化实验结果显示,所有的121截短蛋白抑制铜离子催化产生活性氧的能力和相应全长蛋白相比均显著性降低。本论文研究结果显示,天然存在的α-Syn C端截短蛋白α-Syn121聚集性及细胞毒性均显著性强于α-Syn全长,并且α-Syn121的聚集物能够刺激Caspase-1剪切α-Syn全长产生α-Syn121,形成更多细胞内α-Syn聚集物沉积并进一步激活Caspase-1,导致神经细胞死亡,该恶性循环可能在PD的发生发展中发挥重要作用。此外,本论文研究结果表明,C端122-140片段在α-Syn与铜离子的结合中发挥重要作用,121截短蛋白抑制铜离子产生活性氧的能力较相应α-Syn全长显著性降低。我们的研究结果提示Caspase-1以及α-Syn121之间的恶性循环可能在PD的发生发展中发挥重要作用,靶向清除或抑制Caspase-1及α-Syn121的策略对PD具有潜在的治疗效果。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：

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图 1. （A）William Richard Gowers 关于帕金森病的插图，刊登于 1886 年的神经系统疾病手册，来自维基百科 Parkinson's disease 词条；（B）PD 患者脑部黑质区路易体放大不同倍数的照片，来自于维基百科 Lewy body 词条。1.3 路易体1912 年，Fritz Jakob Heinrich Lewy 描述了帕金森病患者脑部出现嗜酸性的细胞内沉积，Konstantin Nikolaevich Tretiakoff 于1919年将其命名为路易体（Lewybodies）[25]。根据路易体的形态可将其分为脑干和皮质类型，脑干型路易体为球形结构，直径为 8-30 m，透明核心被外围的浅色晕圈环绕，并由 7-20 nm 宽的纤维组成，具有致密的颗粒状物质和囊状结构；皮质类型定义尚不明确，缺乏晕圈，形状为纺锤状或线状，一般出现在受影响神经元的轴突和树突中（图 1B）[26]。1997 年，Spillantini, M. G. 等人发现存在于散发性 PD 患者脑部的路易体对 -突触核蛋白具有强烈的免疫反应性，确定了 -突触核蛋白为路易体的主要成分

氨基酸序列,氨基酸序列,附着蛋白,细胞核

华中科技大学博士学位论文研究发现 -Syn 广泛定位于哺乳动物大脑神经元的细胞核中，表明 -Syn 在细胞核中起作用[32]。 -Syn 通过结合囊泡相关膜蛋白 2（Vesicle-associatemembrane protein 2，VAMP2）调节可溶性 NSF 附着蛋白受体（Soluble NSattachment protein receptor，SNARE）复合物组装，促进突触前末端的突触小泡融合[33]。 -Syn 在神经元高尔基体的运作和囊泡运输中也起到重要作用[34]。同时 -Syn 对于认知功能的正常发育是必不可少的，研究表明 -Syn 敲除小鼠在空间学习和工作记忆上严重受损[35]。

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