接触性热痛诱发电位正常值及对虚拟现实镇痛评价、中国人群腓骨肌萎缩症及MANF抑制MPZ突变细胞内质网应激

发布时间：2020-06-30 17:17

【摘要】：目的1.建立中国人群接触性热痛诱发电位(CHEPs)正常参考值。2.采用CHEPs客观评价虚拟现实(VR)的镇痛作用,评价反复应用VR其镇痛作用是否降低。3.研究中国人群腓骨肌萎缩症临床和基因突变特点。4.探讨中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)在S63de1 MPZ突变RT4-6P2T施万细胞内质网应激(ERS)中的作用。方法1.于2014年12月31日至2016年12月31日招募健康志愿者151名,分别在右前臂掌侧、C7棘突右侧、T12棘突右侧以及右外踝上方进行CHEPs检查。探讨不同刺激次数、不同基线温度对CHEPs参数的影响;评价年龄、性别对CHEPs参数的影响,建立正常参考值;评价CHEPs短期、长期重复性。2.于2016年3月1日至2016年12月31日招募健康志愿者76名,分别于基线水平和VR体验下进行CHEPs检查,并连续三周重复检查;客观评价VR的镇痛作用,探讨反复应用VR其镇痛作用是否减弱。3.收集2012年12月31日至2017年12月31日就诊于解放军总医院且临床诊断为CMT的患者151名,进行病史采集、神经系统查体、实验室检查、神经传导检查(NCS)以及高通量靶向测序,研究其临床和基因突变特点。4.构建慢病毒载体质粒 pLVX-MPZ(MUT)-PGK-Puro 和 pLVX-PGK-Puro,稳定转染RT4-D6P2T细胞系。实验分组:空白对照组、空白对照+MANF组、慢病毒组、慢病毒+MANF 组、S63de1MPZ 组、S63delMPZ+MANF 组;MANF干预时间为24h。采用CCK8进行细胞增值-毒性检测;采用Annexin-FITC/PI双染、流式细胞术进行细胞凋亡检测;采用JC-1进行线粒体膜电位检测(△Ψm);检测各组 MANF、GRP78、CHOP mRNA;Western Bloting 检测各组MANF、GRP78、CHOP等蛋白表达;使用共聚焦显微镜检测各组MANF、GRP78、CHOP等蛋白表达;ER-Tracker、mito-tracker观察内质网、线粒体形态;检测内质网钙离子浓度。结果1.(1)分别进行3次、5次、10次刺激后发现,N2-P2波幅(χ2 = 54.64,P0.001)随刺激次数增加明显下降;(2)年龄和性别的交互因素对右前臂掌侧“N2波潜伏期/身高(msec/cm)”有显著影响(P=0.017)。随着年龄的增长,“N2波潜伏期/身高(msec/cm)”延长,;女性健康志愿者“N2波潜伏期/身高(msec/cm)”较男性健康志愿者缩短。年龄因素对T12处“P2波潜伏期/身高(msec/cm)”(P=0.015)以及右外踩上方N2-P2波幅有显著影响(P0.001),随着年龄的增长,“P2波潜伏期/身高(msec/cm)”延长;N2-P2波幅下降;(3)建立了中国人群CHEPs正常参考值;基线温度升高至35℃时,N2波潜伏期/身高明显缩短(t = 5.45,P0.001),P2波潜伏期/身高明显缩短(χ2 =-4.06,P0.001),N2-P2 波幅明显升高(T =-5.01,P0.001);(4)CHEPs 具有良好的短期及长期重复性。2.在VR环境下,N2波潜伏期/身高较基线水平明显延长(F = 9.497,P = 0.002),N2-P2波幅较基线水平明显下降(F = 65.752,P0.001),VAS评分较基线水平明显下降(F = 28.43,P0.001)。反复应用VR其镇痛作用并不减弱。VAS评分与N2-P2波幅呈中度相关关系(r = 0.532,P0.001)。3.120例临床诊断为CMT的患者进行了基因检测,41例携带已报道致病基因,明确诊断为CMT;16例携带未报道突变,考虑可能致病;23例携带未报道突变,考虑为非致病突变;10例证实或可能为其他疾病;30例未查到基因突变。在明确诊断为CMT的41例患者中,14(34%)例为PMP22基因重复突变,诊断为CMT1A;9(22%)例为GJB1基因突变,诊断为CMTX1;其中24例为CMT1型,占所有明确诊断CMT患者的59%;PMP22基因重复突变导致的CMT1A占CMT1的58%。4.(1)S63delMPZ组与前四组相比,细胞增殖能力下降(P0.001),凋亡增加(P0.001);S63delMPZ+MANF 组与 S63delMPZ 组相比,细胞增殖增多(P=0.005),凋亡减少(P0.001)。(2)S63del MPZ 组△Ψm下降(P0.001)(3)S63del MPZ 组 MANF、GRP78、CHOP mRNA 较前表达增加(P0.001);S63del MPZ+MANF 组与 S63del MPZ 组相比,GRP78、CHOP mRNA 表达下降(P0.001)。(4)在免疫印迹分析中,S63delMPZ 组 MANF、GRP78、CHOP、ATF6、P-PERK/PERK、P-IRE1/IRE1、Bax、Caspase3 表达上调(P0.001),Bc12 表达下调(P0.001);S63delMPZ+MANF 组与 S63delMPZ 组相比,GRP78、CHOP、ATF6、Bax、Caspase3 表达下调(P0.001),Bcl2 表达上调(P0.001)。(5)在免疫荧光分析中,S63delMPZ 组 MANF、GRP78、CHOP、Bax、Caspase3 表达上调(P0.001),Bc12 表达下调(P0.001);S63del MPZ+MANF 组与 S63del MPZ 组相比,GRP78、CHOP、Bax、Caspase3表达下调(P0.001),Bcl2 表达上调(P0.001)。(6)在 S63delMPZ 组,ERtracker、mito-tracker可见内质网、线粒体形态改变。(7)在S63delMPZ组,内质网钙离子浓度下降,S63del MPZ+MANF组与S63del MPZ组相比,内质网钙离子浓度升高。结论1.(1)建立了不同年龄组、不同性别中国人群CHEPs正常参考值范围;(2)CHEPs各项参数受年龄、性别影响;(4)提高基线温度后,CHEPs潜伏期缩短、波幅升高;(5)CHEPs具有较好的短期和长期重复性。2.(1)CHEPs客观评价了 VR技术的镇痛作用;(2)反复应用VR其镇痛作用不会降低。3.(1)丰富了我国CMT临床和基因突变资料;(2)发现的未报道可能致病突变拓展了 CMT的基因谱。4.(1)S63del MPZ 突变 RT4-6P2T 施万细胞产生 ERS;(2)MANF 在 S63del MPZ突变RT4-D6P2T施万细胞ERS中具有保护性作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R746.4
【图文】：

对其父母、姐姐进行验证发现：父母均为杂合突变，姐姐为纯和突变；携带逡逑ＹＡＲＳ（ｃ．ｌ７６Ｔ＞Ｃ）宋变的患者，母亲携带这一突变，父亲不携带这一突变；携带逡逑ＧＪＢｌＣｃ．４９０Ｃ＞Ｔ；）突变的患者，家族中多人患病（图１），家族中患者均携带这一逡逑突变。１６名患者基因突变情况见表４。逡逑逦■堒逡逑ｋ—Ｊ邋＾逡逑□—４逦ａ—－0逦６＾３逡逑■逦ｍ逦0逡逑／逡逑图１携带未报道ＧＪＢｌ（ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ）突变家系逡逑表４邋１６例未报道基因突变特点逡逑左侧正中神经逡逑编逦家族运动传导速度逡逑号逦基因突变逦氨基酸改变逦史逦（ｍ／ｓ）逦疾病亚型逡逑＿１逦ＬＩＴＡＦ（ｃ．３２Ｃ＞Ｇ）逦ｐ．ＴｌｌＳ逦＋逦２８逦ＣＭＴ１Ｃ逡逑＿２逦ＰＭＰ２２（ｃ．ｌｌ７Ｇ＞Ｔ）逦ｐ．Ｗ３９Ｃ逦＋逦２３逦ＣＭＴ１Ｅ逡逑＿３逦ＮＥＦＬ（ｃ．２８０Ｃ＞Ｔ）逦ｐ．Ｌ９４Ｆ逦＋逦３２逦ＣＭＴ１Ｆ逡逑４逦ＭＦＮ２（ｃ．４９７Ｃ＞Ｔ）逦ｐ．Ａ１６６Ｖ逦＋逦４３逦ＣＭＴ２Ａ逡逑逦ＡＡＲＳ（ｃ．８２６Ｇ＞Ａ）逦ｐ．Ａ２７６Ｔ逦＋逦４１逦ＣＭＴ２Ｎ逡逑６逦ＤＹＮＣ１Ｈ１（ｃ．１１７６５Ｃ＞Ｔ）逦ｐ．Ｐ３９２２Ｌ逦－逦４１逦ＣＭＴ２０逡逑７逦ＬＲＳＡＭｌ（ｃ．ｌ９３０Ｇ＞Ｔ）逦ｐ．Ｇ６４４Ｃ逦－逦３９逦ＣＭＴ２Ｐ逡逑８逦ＬＲＳＡＭｌ（ｃ．ｌｌ７８Ｔ＞Ａ）逦ｐ邋N３９３Ｑ逦－逦４２逦ＣＭＴ２Ｐ逡逑５８逡逑

逦解放军医学院博士学位论文逦逡逑结果逡逑１．各组细胞培养２４ｈ后的细胞形态逡逑各组ＲＴ４－Ｄ６Ｐ２Ｔ大鼠源性施万细胞于５％Ｃ０２，邋３７°Ｃ细胞培养箱中培养２４邋ｈ逡逑后完全贴壁，细胞伸出伪足，呈不规则形，各组细胞形态、密度、生长状况无明逡逑显差异（图１）。逡逑

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本文编号：2735581