神经干细胞隧道纳米管形成及对脑缺血再灌注模型保护作用研究
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R743.3
【图文】:
米管形成及影响因素脑微血管内皮细胞是一层薄的贴壁细胞,易受化学、物理和机械刺激影响,构血液和之间的可变形固体血管壁之间分界面[1]。在微观层面,内皮细胞(ECs)中央平细胞核细长。ECs 包含 Weibel-Palade 棒管状小体,这是一种长杆状的,存储和分细胞器,可释放血管性血友病因子和 P-选择素等因子。血脑屏障(Blood-brain baBBB)的电子显微镜研究表明 BMECs 形态和代谢特征不同于其周围组织[2], BB神经组织和血液成分之间的分界面[3],对大脑微环境进行调节以保证正常神经活动利进行。BBB 由四个主要细胞元素(图 1-1),即大脑微血管内皮细胞(BMECs)、胶质细胞终足、小胶质细胞和周细胞[4]。与外周微脉管系统不同的是,大脑微脉统(血管直径< 20μm)不仅保持大脑的血液供应,也能促进神经元和神经胶质细胞的信息传递[5]。经过多年的研究,现在 BMECs 被认为不仅是一个简单的解剖和生障,也是一个高度活跃的代谢系统,合成各种物质以滋养神经细胞、调节血管舒缩[6]。此外,BMEC 功能障碍可以触发大脑组织损伤,如中风、创伤性脑损伤、神行性疾病,这些损伤通过反馈回路加剧 BMECs 功能障碍[7]。BMECs 的损伤在对
在生物安全柜中进行相关操作。11. Nocodazole 处理神经干细胞我们选择Nocodazole这种微管蛋白抑制剂,作为TNT形成抑制物,与其对照组进行分析。在共培养之前,将Nocodazole以5 10-8mol/L的终浓度加入共培养培养液中,并进一步孵育4小时。随后将含有Nocodazole的培养液更换为正常DMEM/F12继续培养24小时。12. NSCs 与 BMECs 共培体系我们选择 NSCs 的完全培养液作为共培体系的基础培养基(图 1-2)。因为该实验主要研究由神经干细胞这种活力相对较强的细胞所发出的 TNT,BMECs 需要模拟一种细胞应激状态,故采用原代培养传代换液 6 代之后的 BMECs,同时进行培养基的血清剥夺,人为造成 BMECs 的相对 恶劣 条件,观察神经干细胞对其的 救助功能。共培时间设定为 24 小时,因为相关研究证实,24 小时左右 TNT 已经形成,并相对较稳定。
图 1-3、神经干细胞球鉴定图 1-3:a ~ c. 神经干细胞细胞球;d ~ e. 神经干细胞爬出;a. d. 细胞核 DAPI 染色;b. e. 神经干细胞标记物 Nestin 染色;c. f. 前两者融合图。Figure 1-3: The identification of neural stem cell globesa ~ c. Neural stem cell sphere; d ~ e. Neural stem cells climb out;a. d. Nuclear DAPI staining; b. e. neural stem cell marker Nestin staining; c. f. the first twofigures fusion.二、 脑微血管内皮细胞原代培养与鉴定我们采用两步酶解法对小鼠脑皮质的 BMECs 进行原代培养,纯化血管段后可见如图 1-4a 所示梭形或椭圆形 BMECs 构成的呈条索状脑微血管片段;继续培养可见BMECs 从贴壁的微血管段爬出,短条索状,经如上文实验方法部分换液后残余的杂质部分不断减少,周细胞、成纤维细胞等非目的细胞比例越来越少。随着培养时间的延长,内皮细胞不断爬出,大约一周时间,可见 BMECs 融合成
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本文编号:2746626
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