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神经干细胞隧道纳米管形成及对脑缺血再灌注模型保护作用研究

发布时间:2020-07-08 13:55
【摘要】:研究背景与目的脑卒中是全球致死率和致残率最高的三大疾病之一,其中87%是脑梗死。对于急性脑梗死,目前唯一被FDA批准的药物治疗手段是早期溶栓。但溶栓时间窗限制相对严格,95%以上的患者无法在发病时间窗内到达医院进行溶栓治疗。我国已经慢慢步入老龄化社会,脑卒中致死率、致残率逐年升高,并且严重降低了患者的生存质量、平均寿命,给国民经济带来沉重的负担。因此,科研人员探索新的、能够覆盖更多患者的缺血性脑卒中治疗策略具有极其重要的现实意义。近几年,涌现出许多神经干细胞在脑卒中治疗领域的机制研究,这为解决脑卒中这一世界性难题提供了新的思路和方法。在急性脑卒中的研究中,神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)对于微血管内皮细胞的保护作用尚不明确。脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)不仅是脑微血管腔的内衬细胞,更能分泌活性因子来影响神经元的功能状态。BMECs的损伤是急性脑梗死后缺血再灌注损伤的基本动因。由于缺血再灌注损伤,BMECs发生水肿,暴露皮下胶原。最终,导致白细胞、血小板粘附,微血栓形成;同时BMECs的线粒体受损,被强烈激活进行氧化活动,产生大量氧自由基,加重脑组织损伤。然而,目前在神经干细胞治疗脑梗死的研究中,多数研究聚焦于受损神经组织的修复,而对于脑梗死后缺血再灌注损伤中,NSCs对BMECs的保护作用尚不清楚。为此,本研究就NSCs修复缺血再灌注损伤BMECs的机制进行了一系列实验探索。本研究证实了NSCs可以通过直接接触的方式保护缺血再灌注损伤的内皮细胞。在实验中,我们成功分离和培养了NSCs和BMECs;为了进一步模拟缺血再灌注损伤中脑微血管内皮细胞所处的病理生理条件,我们建立了NSCs和BMECs的共培养模型;并证实了NSCs能与BMECs形成隧道纳米管(Tunneling nanotubes,TNTs),这是一种只在哺乳动物细胞间形成的桥连,是一种细胞间的特殊连接方式,主要由a-微管蛋白和丝状肌动蛋白聚合构成,可进行长距离的线粒体转运。TNT是由表层的细胞膜和内部的细胞骨架构成,其长度和直径可在较大范围内波动,不同类型的细胞和不同的培养条件可能会造成程度上的差异。TNT可以介导了细胞间的物质运输和信号交流,凭借其较宽口径以及相对较长的长度,在转运分子量较大的物质甚至细胞器上拥有得天独厚的优势。(1)在该研究中鉴定发现了BMECs和NSCs之间TNT的形成,以及MSEC基因对TNTs形成的促进作用、诺考达唑(Nocodazole,微管蛋白解聚剂)对TNTs的抑制作用。(2)因TNT缺少特异性标记物,将NSCs添加MSEC或Nocodazole预处理来影响TNT形成,对MCAO模型进行干细胞移植治疗。检测主要氧化应激因子SOD、H_2O_2、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px和MDA表达的变化;分析预处理因素在线粒体凋亡信号通路中的作用差异,及其对MCAO模型病理学、功能学上的作用和机制。本研究主要通过离体实验、在体实验探究NSCs在脑卒中治疗作用新机制,为干细胞疗法进一步造福人类提供一定的理论依据。实验方法细胞实验部分(1)原代分离培养神经干细胞、脑微血管内皮细胞;(2)Nestin抗体鉴定原代培养的神经干细胞、Ⅷ因子抗体鉴定分离出来脑微血管内皮细胞;(3)构建了神经干细胞、脑微血管内皮细胞共培养模型;(4)对脑微血管内皮细胞进行CFSE标记;(5)对神经干细胞进行线粒体mitotracker示踪;(6)构建MSEC慢病毒;(7)对神经干细胞进行MSEC转染或Nocodazole预处理;(8)抽提预处理各组神经干细胞普通RNA,PCR检测ki-67表达水平;(9)激光共聚焦显微镜观察TNTs形成;动物实验部分(1)MCAO模型建立;准备MSEC慢病毒感染、Nocodazole预处理神经干细胞、空病毒转染神经干细胞和PBS预处理神经干细胞作为对照组;(2)对MCAO模型进行神经干细胞移植;(3)作冰冻切片染色,对移植细胞进行示踪;电镜观察血脑屏障附近结构;(4)TTC染色明确脑梗模型建立,并比较脑梗塞面积;(5)尼氏体染色,观察神经干细胞移植后脑组织形态学改变,并计数神经元;(6)对各组MCAO模型鼠进行mNSS行为功能学评分;(7)检测动物模型中氧化应激相关因子表达变化;(8)Western Blot检测对MCAO模型干预后,线粒体凋亡通路上的关键分子Bcl-2、Bax和Cyt-c的表达。结果(1)原代培养的BMECsⅧ因子抗原阳性,NSCs Nestin抗原阳性。证明细胞分离成功;(2)结果证明BMECs、NSCs共培体系中存在有TNTs形成;(3)过表达MSEC基因可以促进TNT形成,Nocodazole预处理NSCs抑制细胞间TNT形成;(4)MSEC过表达病毒转染和Nocodazole预处理操作不影响NSCs的增殖活性;(5)构建小鼠MCAO模型,TTC染色显示单侧脑梗塞病灶形成;(6)尼氏体染色、神经功能学mNSS评分结果显示:MSEC过表达促进神经干细胞对MCAO保护作用;Nocodazol预处理削弱神经干细胞对MCAO保护作用;(7)western blot检测结果显示:MSEC预处理神经干细胞上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax和通路下游分子Cyt-c的表达;Nocodazole预处理结果则相反;(8)总体上,MSEC预处理神经干细胞能促进抗氧化因素的作用,抑制H2O2、ROS、MDA等氧化因素;采用Nocodazole预处理神经干细胞得到相反的结果。结论在本研究中,我们成功构建BMECs和NSCs共培养模型,验证发现了BMECs和NSCs之间TNTs的形成。MSEC基因对TNTs形成有促进作用、Nocodazole预处理神经干细胞会阻碍TNTs形成。TNT缺少特异性标记物,在细胞密度高的脑组织内难以直接观察。NSCs添加MSEC或Nocodazole预处理后,对MCAO模型进行移植治疗时,TNT促进因素MSEC预处理神经干细胞更能削弱细胞的线粒体凋亡、减弱氧化应激反应;TNT抑制因素Nocodazole预处理结果则相反。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R743.3
【图文】:

模式图,血脑屏障,模式图


米管形成及影响因素脑微血管内皮细胞是一层薄的贴壁细胞,易受化学、物理和机械刺激影响,构血液和之间的可变形固体血管壁之间分界面[1]。在微观层面,内皮细胞(ECs)中央平细胞核细长。ECs 包含 Weibel-Palade 棒管状小体,这是一种长杆状的,存储和分细胞器,可释放血管性血友病因子和 P-选择素等因子。血脑屏障(Blood-brain baBBB)的电子显微镜研究表明 BMECs 形态和代谢特征不同于其周围组织[2], BB神经组织和血液成分之间的分界面[3],对大脑微环境进行调节以保证正常神经活动利进行。BBB 由四个主要细胞元素(图 1-1),即大脑微血管内皮细胞(BMECs)、胶质细胞终足、小胶质细胞和周细胞[4]。与外周微脉管系统不同的是,大脑微脉统(血管直径< 20μm)不仅保持大脑的血液供应,也能促进神经元和神经胶质细胞的信息传递[5]。经过多年的研究,现在 BMECs 被认为不仅是一个简单的解剖和生障,也是一个高度活跃的代谢系统,合成各种物质以滋养神经细胞、调节血管舒缩[6]。此外,BMEC 功能障碍可以触发大脑组织损伤,如中风、创伤性脑损伤、神行性疾病,这些损伤通过反馈回路加剧 BMECs 功能障碍[7]。BMECs 的损伤在对

细胞模型,共培养,共培


在生物安全柜中进行相关操作。11. Nocodazole 处理神经干细胞我们选择Nocodazole这种微管蛋白抑制剂,作为TNT形成抑制物,与其对照组进行分析。在共培养之前,将Nocodazole以5 10-8mol/L的终浓度加入共培养培养液中,并进一步孵育4小时。随后将含有Nocodazole的培养液更换为正常DMEM/F12继续培养24小时。12. NSCs 与 BMECs 共培体系我们选择 NSCs 的完全培养液作为共培体系的基础培养基(图 1-2)。因为该实验主要研究由神经干细胞这种活力相对较强的细胞所发出的 TNT,BMECs 需要模拟一种细胞应激状态,故采用原代培养传代换液 6 代之后的 BMECs,同时进行培养基的血清剥夺,人为造成 BMECs 的相对 恶劣 条件,观察神经干细胞对其的 救助功能。共培时间设定为 24 小时,因为相关研究证实,24 小时左右 TNT 已经形成,并相对较稳定。

神经干细胞,鉴定图,标记物,细胞核


图 1-3、神经干细胞球鉴定图 1-3:a ~ c. 神经干细胞细胞球;d ~ e. 神经干细胞爬出;a. d. 细胞核 DAPI 染色;b. e. 神经干细胞标记物 Nestin 染色;c. f. 前两者融合图。Figure 1-3: The identification of neural stem cell globesa ~ c. Neural stem cell sphere; d ~ e. Neural stem cells climb out;a. d. Nuclear DAPI staining; b. e. neural stem cell marker Nestin staining; c. f. the first twofigures fusion.二、 脑微血管内皮细胞原代培养与鉴定我们采用两步酶解法对小鼠脑皮质的 BMECs 进行原代培养,纯化血管段后可见如图 1-4a 所示梭形或椭圆形 BMECs 构成的呈条索状脑微血管片段;继续培养可见BMECs 从贴壁的微血管段爬出,短条索状,经如上文实验方法部分换液后残余的杂质部分不断减少,周细胞、成纤维细胞等非目的细胞比例越来越少。随着培养时间的延长,内皮细胞不断爬出,大约一周时间,可见 BMECs 融合成

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本文编号:2746626

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