L型钙通道介导黑质铁聚积及对多巴胺能神经元损伤的机制探讨

发布时间：2020-07-10 07:35

【摘要】：铁是维持细胞功能的重要辅助因子,也是维持神经元功能的必需元素,广泛参与体内代谢过程。然而,研究发现,黑质区铁聚积参与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的发病过程。但目前铁选择性沉积于黑质区的具体原因尚未明确。脑内过量的铁可以通过Fenton反应与H_2O_2生成大量的OH·,加重细胞氧化应激反应。越来越多的证据表明,脑内铁聚积与神经退行性疾病有关。有证据表明,L型Ca~(2+)通道(L-type calcium channels,LTCCs)可能介导Fe~(2+)进入多巴胺(dopamine,DA)能神经元参与PD发病过程,使用LTCCs阻断剂能延缓PD的发病;然而,LTCCs参与PD发病的具体机制仍不明确。中脑DA能神经元存在自主起搏现象,其自主起搏依赖L型Cav1.3型钙通道。研究还发现,高铁状态下,LTCCs是铁进入心肌细胞的主要途径。为探讨在PD发病过程中,DA能神经元上LTCCs是否直接介导Fe~(2+)进入细胞,以及Ca~(2+)对Fe~(2+)造成的DA能神经元毒性的影响及可能机制,本实验以DA能MES23.5细胞和原代培养的腹侧中脑(ventral mesencephalon,VM)神经元为观察对象,选用小剂量的MPP~+(5μmol/L)预处理细胞24 h,在不同浓度的Fe~(2+)和/或Ca~(2+)作用下,应用免疫荧光技术观察细胞核形态的变化,流式细胞术检测细胞内活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)的改变,免疫印迹法检测凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦显微镜技术检测VM神经元摄铁功能的变化以及Fe~(2+)对VM神经元内Ca~(2+)浓度的影响,同时观察LTCCs阻断剂伊拉地平对上述作用的影响。研究结果如下:1.应用Hoechst染色,我们检测了MES23.5细胞的细胞核形态的变化。与MPP~+组相比,MPP~+/Fe~(2+)共处理组的细胞核损伤显著,出现明显的核固缩、碎裂和染色质边集等凋亡的形态学变化(P0.001);而应用钙通道阻断剂伊拉地平对Fe~(2+)造成的细胞核损伤有明显的保护作用(P0.01)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共处理组细胞的核损伤远大于MPP~+/Fe~(2+)共处理组(P0.01);而应用钙通道阻断剂伊拉地平对Ca~(2+)和Fe~(2+)共同造成的细胞核损伤有明显的保护作用(P0.01)。2.应用MAP2和Hoechst双染,我们检测VM神经元细胞核形态的变化。与MPP~+组相比,MPP~+/Fe~(2+)共处理组的细胞核损伤数目增加(P0.001),出现明显的核固缩、碎裂等;而应用伊拉地平对Fe~(2+)造成的VM神经元损伤有明显保护作用(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共处理组的损伤远大于MPP~+/Fe~(2+)共处理组(P0.05);而应用伊拉地平对Ca~(2+)和Fe~(2+)共同造成的VM神经元的核损伤有明显的保护作用(P0.05)。3.应用流式细胞术,我们检测了MES23.5细胞的ΔΨm变化。与MPP~+组相比,Fe~(2+)共孵育可以使ΔΨm降低25%(P0.001);而应用伊拉地平能明显改善Fe~(2+)造成ΔΨm降低的情况(P0.01)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)处理组的ΔΨm比MPP~+/Fe~(2+)处理组降低12%(P0.05);而应用伊拉地平能明显改善Ca~(2+)和Fe~(2+)造成ΔΨm降低的情况(P0.001)。4.应用流式细胞术,我们同时检测了VM神经元ΔΨm的变化。与MPP~+组相比,MPP~+处理后加Fe~(2+)孵育可以使ΔΨm降低26%(P0.001);而应用伊拉地平可改善Fe~(2+)造成VM神经元ΔΨm降低的情况(P0.01)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共处理组的细胞ΔΨm,比MPP~+/Fe~(2+)共处理组降低11%(P0.01);而应用伊拉地平能明显改善Ca~(2+)和Fe~(2+)造成VM神经元ΔΨm降低的情况(P0.001)。5.运用荧光染料H_2DCF-DA,我们检测了细胞内ROS的水平。MPP~+/Fe~(2+)共处理组的细胞ROS水平约为MPP~+处理组的1.8倍(P0.001);而应用伊拉地平可部分阻止Fe~(2+)造成的ROS的升高(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共处理组的细胞ROS水平约为MPP~+/Fe~(2+)处理组的1.28倍(P0.05);而应用伊拉地平可部分阻止Ca~(2+)和Fe~(2+)造成的VM神经元内ROS水平的升高(P0.001)。6.应用western blot,我们检测了MES23.5细胞内激活型caspase-3蛋白水平的变化。MPP~+/Fe~(2+)组的激活型caspase-3蛋白的表达量是MPP~+组的2.3倍(P0.001);而伊拉地平可部分阻断Fe~(2+)造成的MES23.5细胞内激活型caspase-3蛋白表达量的增加(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共处理组激活型caspase-3的表达量是MPP~+/Fe~(2+)共处理组的1.3倍(P0.05);而应用伊拉地平能明显阻断Ca~(2+)和Fe~(2+)造成MES23.5细胞内caspase-3蛋白的激活(P0.001)。7.我们同时检测了VM神经元的激活型caspase-3蛋白水平的变化。MPP~+/Fe~(2+)共处理组的激活型caspase-3蛋白水平的表达量是MPP~+组的3.02倍(P0.001);而应用伊拉地平可部分阻断Fe~(2+)对VM神经元造成的损伤(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)组的激活型caspase-3的表达量是MPP~+/Fe~(2+)组的1.59倍(P0.01);而应用伊拉地平能明显阻断Ca~(2+)和Fe~(2+)造成VM神经元内caspase-3蛋白的激活(P0.001)。8.5μmol/L MPP~+处理体外培养的VM神经元24 h后,应用荧光染料calcein作为指示剂,利用激光共聚焦显微镜检测VM神经元的摄铁能力,其荧光越强,摄铁能力越弱。结果显示,使用100μmol/L FeSO_4灌流,与对照组相比,VM神经元的荧光强度降低,表明其摄铁能力增加;当灌流液中加入10μmol/L伊拉地平后,与MPP~+组相比,VM神经元的荧光强度增加,表明其摄铁能力减弱;当灌流液中加入10μmol/L的Bayk8644后,与MPP~+处理组相比,VM神经元的摄铁能力明显增强。9.利用激光共聚焦显微镜,我们进一步检验了Fe~(2+)对VM神经元细胞内游离Ca~(2+)浓度是否有影响。与对照组相比,MPP~+、MPP~+/Ca~(2+)(2.5 mmol/L)共处理组的胞内Ca~(2+)水平随着时间的推移,并没有发生大幅度的变化。与MPP~+组相对比,MPP~+/Fe~(2+)处理组会促进胞内Ca~(2+)的小幅度升高。与MPP~+/Fe~(2+)组相比,增大细胞外Ca~(2+)的浓度(增大至2.5 mmol/L),胞内Ca~(2+)浓度大幅升高;同时加入钙通道阻断剂伊拉地平能阻断胞内Ca~(2+)浓度的升高。综上所述,阻断或激活LTCCs,可改变神经元铁的转运过程,即LTCCs可以介导铁的转运。细胞内增加的铁可以导致细胞ΔΨm降低,ROS水平升高,最终激活caspase-3途径引起细胞的凋亡。并且,MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共处理组比MPP~+/Fe~(2+)处理组对细胞的损伤显著增强,而MPP~+/Ca~(2+)组未对细胞造成明显损伤,提示细胞外高Ca~(2+)可显著加重Fe~(2+)的毒性作用。这可能是因为进入到细胞内的Fe~(2+)造成钙通道的持续开放,Ca~(2+)内流增加造成钙超载,也可能是由于游离Ca~(2+)升高加剧了Fe~(2+)的毒性造成的。应用钙通道阻断剂伊拉地平对Fe~(2+)造成的细胞损伤有明显的保护作用。本研究为探索PD发病过程中LTCCs的作用及LTCCs介导铁聚积的机制提供了新的实验依据。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5
【图文】：

青岛大学硕士学位论文结 果1. 免疫荧光技术鉴定原代培养的 VM 神经元纯度应用免疫荧光标记技术，鉴定原代培养的 VM 神经元的纯度。通过计数荧光图像中 MAP2 阳性细胞数和图像中的细胞总数，计算阳性细胞数占细胞总数的百分比，以确定培养的 VM 神经元的纯度。MAP2 是神经元的特异性标记物。通过计数，结果显示 MAP2 的阳性率在 90%以上。

不同处理组MES23.5细胞核形态的改变Fig.2.1MorphologicalchangesinthenucleiofMES23.5cellswithdifferenttreatmentsHoechst33258fluorescentdyestainingwasusedtoobservethenuclearmorphologyinMES23.5cells.A.MorphologicalchangesinthenucleiofMES23.5cells(400×).Incontrolgroup,MPP+groupandMPP+/Ca2+group,thenucleiofMES23.5cellswereroundandlarge.CellsinMPP+/Fe2+groupandMPP+/Ca2+/Fe2+groupexhibitedhyper-cond

图 2.2 不同处理组 VM 神经元细胞核形态的改变Fig.2.2 Morphological changes in the nuclei of VM neurons with different treatmentshe nuclear morphological changes of VM neurons were detected by MAP2 and Hoechst doutaining. A. Morphological changes in the nuclei of VM neurons (400×). White arrow indicates yper-condensed nuclear and fragmentation of chromatin. B. Summarized data showed the numbersondensed nuclei in different treatment groups. Compared with MPP+group, the numbers ondensed nuclei in MPP+/Fe2+group and MPP+/Ca2+/Fe2+group increased significantly. Isradiponferred on a significant protection against the damage in VM neurons induced by Fe2+. The numbf condensed nuclei of MPP+/Ca2+/Fe2+group were more than that in MPP+/Fe2+group, and ifference was statistically significant. Isradipine may partly protect against both Ca2+and Fnduced damage in VM neurons. The data were presented as mean ± S.E.M. of 6 independxperiments. (***P<0.001, compared with the MPP+group;#P<0.05, compared with MPP+/Fe2+groP<0.05, compared with MPP+/Ca2+/Fe2+group).3. 不同处理组 MES23.5 细胞和 VM 神经元 ΔΨm 的变化ΔΨm是反映线粒体功能的关键指标，与凋亡密切相关。应用流式细胞技术检胞内ΔΨm的变化，观察MPP+预处理后Ca2+/Fe2+共处理对MES23.5细胞ΔΨm的++2+

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本文编号：2748631