G蛋白偶联受体激酶5通过NF-κB信号通路促进胶质瘤细胞生物学活性

发布时间：2020-07-14 13:02

【摘要】：背景胶质瘤约占颅内原发性恶性肿瘤的80%,其中胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)的恶性度最高。尽管近些年来化疗药物的研发取得重大进展。胶质母细胞瘤的治疗方案仍以手术切除联合放化疗为主。由于胶质母细胞瘤具有恶性侵袭、快速增殖和血管增生等特点,胶质母细胞瘤患者的中位生存期只有14个月左右。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是种类最多的一类受体超家族,以6次跨膜螺旋结构为特征,介导多种配体,与多种肿瘤的发生发展密切相关。G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptor kinases,GRKs)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,通过磷酸化作用结合并激活G蛋白偶联受体,导致其脱敏。根据其序列同源性,人们将7个GRK亚型(GRK1-7)分为3组。GRK1亚家族包括GRK1和GRK7,GRK2亚家族,包括GRK2和GRK3;以及GRK4亚家族包括GRK4,GRK5和GRK6。GRK1和GRK7主要分布于视网膜,介导光感传导。GRK2、3、5、6分布广泛,在心、脑、肺和肾等组织均有表达。GRK4分布较局限,主要存在于睾丸,可使精子表面GPCR磷酸化。在脑组织部分区域以及肾脏也有少量的GRK4表达。研究显示GRK家族成员的表达和活性在多种病理过程中发生了改变。这其中,GRK5是被研究最多的成员之一。GRK5既可通过使GPCR或非GPCR受体(PDGFR、PGE2R、TSH)脱敏的机制抑制肿瘤进展,又可以通过作用于非受体底物(NPM1、AUKA、p53)促进肿瘤生长。GRK5在不同的组织分布及亚细胞定位可能表现出不同的激酶活性。值得注意的是,在包括胶质瘤在内的许多肿瘤中,都存在10号染色体q24区域的染色体易位,提示该区域基因改变可能与肿瘤发生进展有关。由于GRK5恰好位于10号染色体的q24区域上,提示GRK5表达变化可能与胶质瘤的发生发展有关。但目前GRK5在胶质瘤方面的研究很少。核转录因子-κB家族(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的各转录因子在人体各组织内广泛表达,可以调节肿瘤的细胞进展,细胞增殖和细胞凋亡。最近有研究显示,NF-κB可以调控胶质母细胞瘤的分泌。抑制NF-κB通路可导致IL8,IL6,CCL2,IL-1β和CXCL14等细胞因子/趋化因子的下调,进而抑制与他们有关的通路。GRK5是NF-κB信号通路的重要调节基因,可以增强通路的活性。另一方面,p50和p65反过来也可以直接与细胞核中的GRK5 DNA相结合,从而上调GRK5水平。那么GRK5与NF-κB信号通路的相互作用在胶质瘤中是否存在?对胶质瘤细胞生物学活性是否产生影响?目前尚未发现相关报道。这也促使我们去探究GRK5表达与NF-κB信号通路在胶质瘤中的作用。本研究首先从胶质瘤细胞系和临床组织标本中GRK5及肿瘤相关指标的表达、分布特点和亚细胞定位入手,发现GRK5的“癌基因”属性;然后建立GRK5 knockdown稳转细胞系,通过体内外实验研究GRK5表达下调对胶质瘤细胞生物学活性的影响;最后探讨GRK5-NF-κB信号通路在胶质瘤中的生物学功能及调控机制。以期通过上述研究获得对GRK5在胶质瘤中的生物学功能和作用机理的新认识,为揭示胶质瘤恶性进展的分子机制提供新思路,以及针对GRK5-NF-KB信号通路的胶质瘤早期诊断和靶向药物研发提供新目标。目的第一部分:GRK5在胶质瘤中的表达与定位1.不同病理级别胶质瘤组织中GRK5的表达情况;2.GRK5在胶质瘤组织中的亚细胞定位及分布特点;3.GRK5与胶质瘤干细胞的关系。第二部分:胶质瘤中GRK5的功能研究及GRK5-NF-KB信号通路的内在关系1.GRK5在胶质瘤细胞系中的表达及GRK5 konckdown(简称GRK5-kd)稳转细胞系的建立;2.体内外实验研究GRK5对胶质瘤细胞生物学活性(包括增殖、迁移、侵袭和凋亡等)的影响;3.研究GRK5与NF-κB信号通路在胶质瘤中的相互关系,以及对NF-κB下游产物的影响。方法第一部分:GRK5在胶质瘤中的表达与定位1.通过免疫印迹、real-time PCR和免疫组化检测10例正常脑组织和1 10例不同病理级别的胶质瘤组织中GRK5的表达水平的差异;2.通过免疫组化、免疫荧光观察分析不同级别胶质瘤组织中GRK5的亚细胞定位、分布特点以及与肿瘤血管的关系;3.通过免疫荧光双重染色观察GRK5与肿瘤干细胞标记物CD133的共表达。第二部分:胶质瘤中GRK5的功能研究及GRK5-NF-κB信号通路的内在关系1.通过免疫印迹和real-time PCR检测U87、U251和T98G三种细胞系中GRK5表达水平的差异,筛选出适宜后续功能实验的最佳细胞系。2.建立慢病毒包装的GRK5-kd和GRK5-NC的稳转细胞系,利用CCK-8法、划痕实验和Matrigel侵袭实验和流式细胞仪等方法,用以检测各组细胞的增殖、迁移,侵袭和凋亡等细胞生物学活性的变化,通过建立裸鼠移植瘤模型研究体内环境下GRK5表达变化对胶质瘤增殖的影响。3.利用GRK5 knockdown和NF-κB刺激剂PMA(佛波醇酯)的介入,通过免疫印迹法检测GRK5与NF-κB相关通路蛋白的内在关系。再通过ELISA试剂盒定量分析GRK5下调对NF-κB通路下游细胞因子/趋化因子的影响。结果第一部分:GRK5在胶质瘤中的表达与定位1.qRT-PCR数据显示,与正常脑组织相比,GRK5在胶质瘤组织中异常增高,GRK5在高级别胶质瘤(WHOⅢ/Ⅳ)中的表达水平显著高于低级别胶质瘤(WHO Ⅱ)。免疫印迹结果显示,与正常脑组织相比,GRK5在不同级别胶质瘤组织中蛋白表达水平升高。级别越高的胶质瘤样本中GRK5的表达更高。2.免疫组化显示GRK5主要集中在细胞胞浆表达,胞核内未见明显染色。其胞浆富集程度在低级别胶质瘤中相对较低,染色较浅,而在高级别胶质瘤胞浆中则显著深染。进一步分析后发现GRK5的表达与病理级别呈正相关性。通过将GRK5和Ki-67的表达分析比较后发现,在胶质瘤组织中,GRK5和Ki-67的表达亦呈正相关性。3.通过观察分析胶质瘤中GRK5和血管标记物CD34的表达后发现,GRK5阳性表达常常定位于肿瘤血管附近,特别是在高级别胶质瘤组织中该现象尤为明显。相关性研究显示胶质瘤样本中GRK5和CD34的表达呈正相关。4..免疫荧光双染结果显示,GRK5和肿瘤干细胞标记物CD133在WHO Ⅲ和WHO ⅣⅣ胶质瘤中普遍存在共表达,大多数CD133阳性表达的细胞可同时观察到GRK5阳性表达。第二部分:胶质瘤中GRK5的功能研究及GRK5-NF-κB信号通路的内在关系1.在胶质瘤细胞系U87、U251和T98G中,U251细胞系中的表达水平相对最高。因此我们选择U251细胞系构建慢病毒包装的GRK5 knockdown(实验组)和GRK5-NC(空质粒对照组)稳转细胞系。2.通过Transwell实验发现GRK5下调导致胶质瘤细胞穿膜能力变差;划痕实验的结果则显示GRK5下调后胶质瘤细胞迁移速度减慢。3.通过CCK-8实验检测在体外环境下组间胶质瘤细胞增殖能力的变化。结果显示,GRK5下调后肿瘤细胞的增殖能力显著降低。为进一步检测GRK5下调对模拟体内环境下胶质瘤细胞增殖的影响,我们建立了裸鼠皮下移植瘤模型。皮下注射胶质瘤细胞后,每只小鼠均形成了固态的皮下移植瘤。移植瘤生长曲线显示GRK5下调后肿瘤在体内的生长速度减慢。GRK5下调的皮下肿瘤与阴性对照组和空白对照组的皮下肿瘤相比,尺寸更小,重量更轻。提示下调GRK5可抑制胶质瘤细胞在体内外的增殖能力。4.通过流式细胞术分析各组细胞中的凋亡细胞数的变化。Annexin V-PE/7-AAD双染U251细胞,流式细胞仪检测磷脂酰丝氨酸的外化。分析结果显示:GRK5-KD组的胶质瘤细胞凋亡率达(42.35±3.56)%,明显多于阴性对照组(4.45±0.51)%和空白对照组(2.68±0.3 1)%。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用,Bcl-2家族在已知的许多凋亡通路中都发挥重要作用,通过免疫印迹实验检测分析各组胶质瘤细胞发现,GRK5下调可抑制胶质瘤细胞中Bcl-2的蛋白水平。上述结果表明GRK5在胶质瘤中具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。5.利用GRK5 knockdown和NF-κB刺激剂PMA,通过免疫印迹法检测GRK5与NF-κB通路在胶质瘤中的相互关系。研究结果显示,PMA处理24h之后,磷酸化IκBα(pIκBα)、p50和p65蛋白表达上调,GRK5蛋白水平亦随之升高,提示在胶质瘤细胞中,NF-κB通路蛋白的活化可上调GRK5的蛋白水平。进一步研究发现,GRK5的下调可抑制胶质瘤细胞中pIκBα、p65和p50的表达;重新加入NF-κB刺激剂PMA后,被抑制的pIκBα、p50和p65表达被上调,此时预先knockdown的GRK5蛋白水平也随之升高。该部分研究表明GRK5和NF-κB信号通路在胶质瘤细胞中存在协同促进作用。6.为了进一步分析GRK5下调对NF-κB下游的细胞因子/趋化因子的影响,我们挑选了 CCL2,IL6和IL8作为研究对象。利用ELISA定量分析了 GRK5下调后胶质母细胞瘤细胞基质中三种因子的表达变化。数据分析结果显示,GRK5下调后,NF-κB下游的CCL2,IL6和IL8的表达水平亦随之降低。而加入NF-κB刺激剂PMA可重新上调CCL2,IL6和IL8的蛋白水平。结论第一部分:GRK5在胶质瘤中的表达与定位1.GRK5在胶质瘤组织中异常高表达,并且与胶质瘤病理级别呈正相关性。2.GRK5可能与胶质瘤的血管生成以及维持胶质瘤干细胞的致瘤潜能有关。第二部分:胶质瘤中GRK5的功能研究及GRK5-NF-KB信号通路的内在关系1.下调GRK5表达可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡增加。GRK5在胶质瘤的发病及进展中可能发挥癌基因的作用。2.GRK5与经典的肿瘤信号通路NF-κB在胶质瘤中存在协同促进作用。3.下调GRK5可抑制NF-κB通路的下游细胞因子/趋化因子的表达水平。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41
【图文】：

胶质瘤,高级别,表达水平

图１．实时荧光定量ＰＣＲ检测高级别胶质瘤（ＷＨＯ邋ＩＩＩ／ＩＶ）和低级别胶质瘤（ＷＨＯ逡逑ＩＩ）中邋ＧＲＫ５邋的邋ｍＲＮＡ邋表达水平，＊，尸＜０．０５；邋＊＊，尸＜０．０１．逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｂｙ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ，邋ＧＲＸ５邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｌｏｗ邋ｇｒａｄｅ邋ｇｌｉｏｍａｓ邋ｗａｓ邋ｌｏｗｅｒ邋ｔｈａｎ邋ｉｎ逡逑ｈｉｇｈ邋ｇｒａｄｅ邋ｇｌｉｏｍａｓ邋（＊５邋Ｐ＜邋０．０５，邋＊＊，邋Ｐ＜邋０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｔｏ邋ＮＯＲ）．逡逑ＮＯＲ，ｎｏｒｍａｌ邋ｂｒａｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅ；邋ＩＩ，ＷＨＯ邋ＩＩ邋ｇｌｉｏｍａｓ；邋ＩＩＩ，ＷＨＯ邋ＩＩＩ邋ｇｌｉｏｍａｓ邋ａｎｄ邋ＩＶ，ＷＨＯ逡逑ＩＶ邋ｇｌｉｏｍａｓ．逡逑

胶质瘤,免疫印迹法,蛋白表达,级别

ＮＯＲ邋ＩＩ逦ＩＩＩ逦ＩＶ逡逑２．邋ＧＲＫ５在不同级别胶质瘤样本中的蛋白表达逡逑．免疫印迹法检测正常脑组织和ＷＨＯ邋ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ胶质瘤样本中ＧＲＫ５的直方图显示ＧＲＫ５蛋白相对表达水平，＊＊，户＜０．０１。逡逑

胶质瘤,免疫组织化学法,级别,放大倍数

图３．免疫组织化学法检测不同级别的胶质瘤样本中ＧＲＫ５、Ｋｉ６７和ＣＤ３４的表（放大倍数，ｘｌ00）逡逑ＧＲＫ５在人胶质瘤组织中高表达，并且与病理级别呈正相关性（Ｐ＜邋０．０１，皮尔曼秩和检验）。此外，ＧＲＫ５和Ｋｉ－６７在胶质瘤组织中的表达（Ｆ＜０．０５，斯

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