伊维菌素和莫西克汀诱导胶质瘤细胞自噬作用及机制

发布时间：2020-07-19 03:34

【摘要】：胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤之一。目前的治疗标准是在可行的范围内手术切除,辅助放疗、化疗等。伊维菌素(Ivermectin,IVM)、莫西克汀(Moxidectin,MOX)属于大环内酯类抗生素,在体外和体内均有促进胶质瘤细胞凋亡的作用,因此被认为是潜在的抗癌药物。细胞自噬与凋亡是引起肿瘤细胞死亡的主要途径,自噬在肿瘤治疗中的作用成为研究热点。目前关于伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞自噬作用及机制尚不明确。因此,本研究选用伊维菌素、莫西克汀两种药物,以人胶质瘤细胞系U251和鼠胶质瘤细胞系C6为研究对象。用透射电子显微镜、GFP-LC3转染、Western blot和免疫组织化学法检测自噬发生;MTT法和平板克隆法检测细胞增殖活力;流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡;在动物体内实验中,建立胶质瘤细胞荷瘤模型,证明两种药物在体内诱导胶质瘤自噬发生及作用。本实验旨在研究伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞自噬作用及机制,明确自噬在药物治疗过程中的作用,为干预自噬并联合伊维菌素、莫西克汀治疗胶质瘤提供理论依据。研究结果如下:(1)伊维菌素、莫西克汀在体外诱导胶质瘤细胞自噬发生用透射电子显微镜观察细胞形态,结果显示:药物处理后的胶质瘤细胞中有明显的自噬小体;GFP-LC3质粒转染可定位蛋白,追踪自噬形成,结果显示:药物处理后的胶质瘤细胞中弥散的绿色荧光转变为明亮斑点;用Western blot检测标志性自噬蛋白表达水平变化,结果显示:药物处理后的胶质瘤细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平显著升高(P0.001),而P62表达水平显著降低(P0.01)。(2)伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞自噬发生的机制用Western blot检测自噬信号通路蛋白的表达水平。结果显示:随着伊维菌素、莫西克汀药物浓度升高,AKT/mTOR信号通路上自噬蛋白表达水平显著降低(P0.001)。其次,检测ATP水平,经药物处理后的胶质瘤细胞中ATP水平显著降低(P0.01)。(3)伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞自噬与凋亡的关系用CQ抑制自噬,MTT法和平板克隆法检测细胞增殖活力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示:抑制伊维菌素诱导的自噬后细胞增殖活力降低(P0.01),细胞集落形成率也降低(P0.01),细胞凋亡率升高(P0.05);而抑制莫西克汀诱导的自噬后细胞增殖活力升高(P0.05),细胞集落形成率升高(P0.01),细胞凋亡率降低(P0.01)。(4)在胶质瘤细胞荷瘤模型中,伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤自噬发生用U251细胞建立胶质瘤细胞荷瘤模型。Western blot和免疫组织化学法(LC3)检测药物处理后胶质瘤组织中蛋白表达变化。结果显示:药物处理过的胶质瘤组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平升高,LC3阳性表达升高,证明药物在体内也可以诱导胶质瘤自噬发生。(5)在胶质瘤细胞荷瘤模型中,自噬与凋亡的关系实验过程中记录裸鼠皮下肿瘤体积,根据肿瘤体积趋势和最终体积可以看出:抑制伊维菌素诱导的自噬可以促进胶质瘤死亡,胶质瘤体积显著变小(P0.05);而抑制莫西克汀诱导的自噬降低细胞死亡,肿瘤体积增大(P0.01)。免疫组织化学法(Ki67)和TUNEL法实验结果显示:抑制伊维菌素诱导的自噬Ki67阳性表达降低,荧光表达增多,证明在体内自噬抑制凋亡,降低伊维菌素的治疗效果;而抑制莫西克汀诱导的自噬Ki67阳性表达升高,荧光表达减少。证明莫西克汀诱导的自噬促进凋亡,自噬与凋亡共同促进胶质瘤死亡。综上所述,伊维菌素和莫西克汀在体外、体内均能显著诱导胶质瘤细胞自噬发生,通过抑制AKT/mTOR信号通路,并引起胶质瘤细胞能量降低。在探究自噬与凋亡的关系中,伊维菌素诱导的自噬抑制凋亡,而莫西克汀诱导的自噬促进凋亡。由此可以看出自噬在肿瘤治疗过程中扮演双重角色。因此,干预自噬并联合伊维菌素,莫西克汀将可能成为治疗胶质瘤的有效途径。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

伊维菌素,化学结构式

图 1-1 伊维菌素的化学结构式Fig.1-1 Chemical structure of ivermectin菌素应用现状是一种广谱的抗寄生虫剂，它具有独特的药理特性。可以抑制寄，导致咽壁肌肉瘫痪，从而导致寄生虫饿死，有效的用于对寄生不仅用于人类口服治疗丝虫病的药物，对其他与蠕虫有关的感染多国家被批准用于治疗盘尾丝虫病、淋巴丝虫病、强线虫病，最，越来越多的科研工作者和卫生工作者应用伊维菌素来治疗其他的药物动力及生物化学作用方式，更好的将伊维菌素应用于人类，阿维菌素的发现荣获诺贝尔生理学或医学奖[18-19]。现有文献描述疾病方面的报道。阿维菌素可以调节中枢神经系统中的电离受体有乙醇影响的细胞和行为效应，并可能代表一种新型的抗酒精药究证明，阿维菌素对多种肿瘤细胞具有抑制增殖，促进凋亡的作菌素同属大环内酯类抗生素，随后将目光转向伊维菌素。伊维菌

化学结构式,伊维菌素

临床治疗中找到了一席之地，是治疗丝虫病最成功的药物之一[17为是一种很有前途的抗癌药物[24]。Dou QH 等表明伊维菌素通过阻细胞自噬[25]。Liu Y 等报道伊维菌素抑制胶质母细胞瘤血管生成、imoto 等研究表明伊维菌素能抑制人卵巢癌的 PAK 1 激酶，并阻断研究表明，大环内酯类药物可以作为有效的 MDR 逆转剂[27]。同可以抑制胶质瘤细胞增殖，促进凋亡。因此，伊维菌素有望成为克汀克汀简介大环内酯类抗生素中，莫西克汀（Moxidectin, MOX）属于米尔贝酯类药物。由链霉菌发酵产生，是奈马克丁的衍生物，成分单一相似，有很高的亲脂性，同时具备较强的杀虫活性[29-30]。在兽医生虫，具有长效、安全的优点[31-32]。其结构分子式见图 1-2。

技术路线图,自噬,肿瘤组织,凋亡

前言blot 法检测肿瘤组织蛋白中自噬蛋白的变化；免疫组织化学法检测肿瘤组织切片中自噬蛋白的表达。其次，证明体内自噬与凋亡的关系，探究自噬与凋亡对药物抗肿瘤的作用。通过记录肿瘤体积和裸鼠体重；免疫组织化学（Ki67）检测细胞的增殖状态；TUNEL 法检测细胞凋亡。1.6 本课题的研究技术路线

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