脂多糖对BV-2小胶质细胞的影响及吡咯烷二硫代氨基甲酸的干预效应

发布时间：2020-07-19 09:59

【摘要】：研究背景近年来相关研究报道显示,脑内神经炎症与神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和多发性硬化的发生和发展有密切的关系。神经炎症是由于感染和损伤所引发的机体抵御机制,主要是由胶质细胞与淋巴细胞释放的毒性因子介导所引起的。在先前动物模型使用的研究中,发现在大脑发生炎症时,小胶质细胞和星形胶质细胞被激活,释放促炎症因子和抗炎因子以介导炎症的发生和发展。本次研究主要针对小胶质细胞所介导的炎症反应进行研究,探讨研究小胶质细胞在神经炎症中促进炎症反应发生的主要作用,为干预炎症反应进展提供新的研究方向。小胶质细胞是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中最小的胶质细胞,数量少,大概为CNS神经胶质细胞的10%~20%。小胶质细胞在大脑神经组织中扮演着主要免疫细胞的角色,同时也是神经相关炎症反应的最重要的免疫细胞。同时,无论在神经元的生存还是生命活动中都发挥着重要的支持、保护、营养等作用,并且其外形与免疫系统树突状抗原呈递细胞相似,有效保护CNS免于病原体侵蚀。小胶质细胞在激活的时候会释放炎症前细胞因子,如IL-1、TNF-α以及氮氧化物在内的一系列的炎性因子。在CNS的炎症过程中小胶质细胞同时也表达许多细胞因子的受体,包括炎症前细胞因子和抗炎性细胞因子受体,在调节和诱导小胶质细胞的免疫功能上起关键的作用。最近,也有相关文献报道小胶质细胞与一些神经退行性病变的疾病进程有一定的关联。所以,对于神经炎症的研究中,针对小胶质细胞炎症表达的治疗是对神经炎症治疗过程中一个重要的策略。核转录因子κB(Nuclear transcriptrion factorκB,NF-κB)是一种广泛存在于真核细胞里具有多向转录调节作用的蛋白质,一般该蛋白以非激活的形式存在在几乎所有类型细胞的胞质。NF-κB的激活可以通过多种细胞外信号进行调控NF-κB的靶基因。NF-κB在免疫应答、细胞增生及凋亡等重要功能发挥至关重要的作用,同时也与神经发育、神经变性及可塑性变化等有关。吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是目前NF-κB的活性抑制剂。PDTC能够改变氧化还原状态,金属螫合作用,降低或抑制酶活性,能够抑制通过激活NF-κB途径在小胶质等多种细胞的反应。PDTC由二硫代氨基甲酸酯组成,能分解成异硫氰酸盐和二硫化碳这两种低分子硫醇抗氧化剂,影响NF-κB的DNA结合活性,从而减少NF-κB的活化;另外PDTC还可以直接抑制NF-κB,在LPS诱导的小鼠脓毒性休克模型的研究发现,PDTC是通过减少NF-κB的核转位,抑制NF-κB的活化,使致炎细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6基因的表达减少,炎性反应减轻,降低了小鼠的死亡率。PDTC作为一种抗氧化剂,还可以清除自由基的毒性作用,可以通过减少丙二醛等来降低氧化物质对细胞的损伤,能够用于重金属中毒和酒精中毒的解毒、癌症和获得性免疫抑郁综合征等疾病的辅助治疗。因此,本研究旨在探讨脂多糖对BV-2神经小胶质细胞的影响并观察PDTC对其的干预效应。研究目的1、观测脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对BV-2神经小胶质细胞的影响。2、探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对小胶质细胞炎症反应的干预效应研究方法1、细胞培养BV-2神经小胶质细胞常规接种在含10%胎牛血清、100g/L青霉素、100g/L链霉素的DMEM培养液中,置于37℃、95%空气、5%CO2培养箱内孵育。每48h换液、传代2次,取对数生长期细胞用于实验。2、对BV-2细胞进行传代并随机分为空白照组、L组和L+P组。3、其中对照组细胞加入PBS;L组加入LPS(1μg/ml);L+P组在加入LPS前30分钟加入50μmol/L的PDTC溶液进行干预并置于培养箱中孵育24小时。4、经培养24小时后,用显微镜观察细胞形态的改变,采用ELISA法测定BV-2小胶质细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,同时对细胞行免疫组化和Western blot观察蛋白表达量的改变。结果1.光镜下,O组、L组和L+P组BV-2细胞的形态学改变。静止状态下的小胶质细胞的形态为分支状胞体呈圆形或者椭圆形。L组的BV-2细胞经LPS(1ug/ml)24小时因刺激后活化的细胞数量明显增加,细胞核体积明显变大,并且细胞形态成“阿米巴样”改变。然而,经PDTC预先处理的L+P组中,在加入LPS 30分钟前给予PDTC(50ug/L)进行预处理,活化形态发生变化的BV-2细胞相对于LPS组明显减少。通过统计活化的小胶质细胞数占总细胞数量的比值我们可以得到相同的结果。L组活化的小胶质细胞占总细胞数量的比值明显高于对照组(P0.05),而预先给予PDTC进行处理的L+P组明显降低活化细胞比值(P0.05)。2.ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度的结果中与O组比较,L组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度增高(P0.05);与L组比较,L+P组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度降低(P0.05)。3.通过Western blot结果显示与O组比较,L组中NF-κB p65与TLR4在BV-2小胶质细胞中的表达量明显增加(P0.05);与L组比较,L+P组中NF-κB p65与TLR4在BV-2小胶质细胞中的表达量明显减少(P0.05)。结论1、LPS可诱导BV-2小胶质细胞激活发生形态变化,并且促使BV-2小胶质细胞释放促炎症因子。2、应用PDTC可干预LPS诱导的BV-2小胶质细胞,抑制小胶质细胞的激活,减少其炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：

细胞形态学

L+P 组图 1 O 组、L 组与 L+P 组细胞形态学对比测细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 浓度的结果培养后，取细胞上清液离心 10 分钟去除颗粒和聚合物分装清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 浓度。检测结果显示 L 组与空白对照组比较，L 组细胞上清液中 T（P < 0.05）；与 LPS 组比较，L+P 组细胞上清液 TNF-α、 < 0.05），见表 2 和图 2。表 2 细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 浓度的比较（pg/ml，n=3，O 组 L 组 L+P 组104.1±10.6 141.2±10.2*114.7±5.1&220.9±46.3 350.1±9.5*256.1±51.837.9±6.9 59.9±3.9*43.8±6.8&注：与 O 组比较，*P < 0.05；与 L 组比较，&P < 0.05

蛋白表达,细胞,血清,并用

GroupOGroupLGroupL+P0204060IL-6(pg/ml)图 2 血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 浓t 结果时后取出细胞用细胞刮提取细胞，并用65、TLR4 不同组之间的表达情况。：与 O 组比较，L 组中 NF-κB p65 在）；与 L 组比较，L+P 组中 NF-κB p60.05）。O组 L组 L+P组

蛋白表达,小胶质

κB p65、TLR4 不同组之间的表达情况。p65：与 O 组比较，L 组中 NF-κB p65 在.05）；与 L 组比较，L+P 组中 NF-κB P < 0.05）。B P65ctinO组 L组 L+P组组 NF-κB p65 蛋白表达结果，与 O 组比较，与 O 组比较，L 组中 TLR4 在 BV-2 小比较，L+P 组中 TLR4 在 BV-2 小胶质细O组 L组 L+P组

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