【摘要】：研究背景紫杉醇是临床上最常用的化疗药物之一,通常用于胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等癌症的治疗。然而,紫杉醇治疗通常诱发神经病理性疼痛(paclitaxel-induced neuropathic pain,PINP),且在停药后仍可能持续很长时间。常用的镇痛药物如非甾体类抗炎药、阿片类药物、抗惊厥药及抗抑郁药等对PINP的治疗效果极差。PINP严重影响肿瘤患者的预后和生存质量,且目前缺乏有效的防治措施。因此,深入探讨PINP的治疗靶点是我们亟需解决的关键问题。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是一种核转录因子,可以调节相关基因的表达,如G蛋白偶联受体、生长因子及抗氧化酶等。PPARγ不仅在代谢调控方面发挥不可或缺的作用,大量的研究还表明PPARγ激活在缺血再灌注损伤、中枢神经系统损伤及神经退行性疾病中均起到保护作用。近年来,越来越多的证据表明PPARγ可能是治疗慢性疼痛的潜在药物靶点。Park等首次证实PPARγ激动剂吡格列酮可以有效预防脊髓损伤大鼠模型产生热痛觉过敏。此外,PPARγ激动剂还可以显著缓解炎性痛及神经损伤引起的神经病理性疼痛。然而,PPARγ激活能否有效防治PINP及其机制目前尚不明确。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是体内抗氧化应激防御系统中最重要的转录因子。生理情况下,Nrf2在细胞质中与Keap1结合,然后发生泛素化和快速降解。然而,Nrf2在氧化应激情况下与Keap1分开,在细胞质中聚集并转移至细胞核内,从而结合抗氧化反应元件,然后激活抗氧化基因的表达,如血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等。研究表明活性氧清除剂可以有效防治PINP,这说明氧化应激参与PINP的发生及发展。大量研究证实Nrf2是抵抗氧化应激损伤的重要治疗靶点。然而,Nrf2/HO-1信号通路激活能否有效防治PINP目前尚不明确。鉴于PPARγ激活所产生的神经保护效应大多是由其抗氧化功能所介导的,我们推测PPARγ可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路来缓解PINP。因此,本研究拟采用腹腔注射紫杉醇建立大鼠PINP模型,采用不同给药方案检测PPARγ激动剂及Nrf2激动剂对PINP发生及发展的影响,采用免疫荧光及western blot检测PPARγ、Nrf2及HO-1在脊髓的表达及分布情况,从而验证科学假说。研究方法与结果第一部分PPARγ激活缓解紫杉醇诱发神经病理性疼痛方法:采用雄性SD大鼠作为研究对象,于第0天(0 d)、2 d、4 d及6 d腹腔注射紫杉醇建立PINP模型,于0 d给药前、3 d、7 d、14 d及21 d采用Von Frey丝评估双侧足底机械性缩爪阈值(mechanical paw withdrawal threshold,MPWT)。于14 d腹腔注射罗格列酮,检测单次腹腔注射PPARγ激动剂对PINP大鼠MPWT的影响;于14-18 d连续5天腹腔注射罗格列酮,检测多次腹腔注射PPARγ激动剂对PINP大鼠MPWT的影响;于14 d腹腔注射罗格列酮前30 min先腹腔注射PPARγ拮抗剂,检测PPARγ拮抗剂对罗格列酮缓解PINP的影响;于0-6 d连续7天腹腔注射罗格列酮,检测预防性腹腔注射PPARγ激动剂对PINP大鼠MPWT的影响。采用免疫荧光及western blot检测PPARγ的表达、分布及细胞定位情况。结果:PINP组大鼠MPWT于7 d开始显著下降,一直持续至21 d,而Vehicle组大鼠MPWT在整个观察期间没有显著改变。14 d单次腹腔注射罗格列酮5 mg/kg对PINP大鼠MPWT没有显著影响,而腹腔注射罗格列酮25 mg/kg及50 mg/kg可以显著升高PINP大鼠MPWT,于给药后1 h开始起效,2 h药效达峰,4 h药效消失。此外,14-18 d多次腹腔注射罗格列酮显著升高PINP大鼠MPWT,且不出现耐受现象。事先腹腔注射PPARγ拮抗剂显著逆转了罗格列酮对PINP的缓解作用。预防性腹腔注射罗格列酮显著提高PINP大鼠在7 d及14 d的MPWT,而对21 d的MPWT无显著影响。PINP大鼠脊髓PPARγ表达水平显著降低,而多次腹腔注射罗格列酮显著上调PINP大鼠脊髓PPARγ的表达水平,但这一效果被事先给予PPARγ拮抗剂所阻断。PPARγ主要与神经元共表达,极少数与小胶质细胞及星形胶质细胞共表达。第二部分Nrf2/HO-1信号通路激活缓解紫杉醇诱发神经病理性疼痛方法:采用雄性SD大鼠作为研究对象,PINP模型建立方法同第一部分。于14 d腹腔注射奥替普拉,检测单次腹腔注射Nrf2激动剂对PINP大鼠MPWT的影响;于14-18 d连续5天腹腔注射奥替普拉,检测多次腹腔注射Nrf2激动剂对PINP大鼠MPWT的影响;于14 d腹腔注射奥替普拉前30 min先腹腔注射葫芦巴碱,检测Nrf2抑制剂对奥替普拉缓解PINP的影响;于0-6 d连续7天腹腔注射奥替普拉,检测预防性腹腔注射Nrf2激动剂对PINP大鼠MPWT的影响。采用免疫荧光和western blot检测Nrf2及HO-1的表达、分布及细胞定位情况。结果:14 d单次腹腔注射奥替普拉10 mg/kg对PINP大鼠MPWT没有显著影响,而腹腔注射奥替普拉50 mg/kg及100 mg/kg可以显著升高PINP大鼠MPWT,于给药后0.5 h开始起效,1 h药效达峰,2 h药效消失。此外,14-18 d多次腹腔注射奥替普拉显著升高PINP大鼠MPWT,且不出现耐受现象。事先腹腔注射Nrf2抑制剂显著逆转了奥替普拉对PINP的缓解作用。预防性腹腔注射奥替普拉显著提高PINP大鼠在7 d的MPWT,而对14 d及21 d的MPWT无显著影响。PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1表达水平显著升高,而多次腹腔注射奥替普拉进一步上调PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表达水平,但这一效果被事先给予Nrf2抑制剂所阻断。Nrf2及HO-1主要与神经元共表达,极少数与星形胶质细胞及小胶质细胞共表达。第三部分PPARγ通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解紫杉醇诱发神经病理性疼痛方法:采用雄性SD大鼠作为研究对象,PINP建模方法同第一部分。于14 d腹腔注射罗格列酮前30 min先腹腔注射葫芦巴碱,检测Nrf2抑制剂对罗格列酮缓解PINP的影响;采用免疫荧光和western blot检测Nrf2及HO-1的表达及分布情况。结果:14 d单次腹腔注射罗格列酮50 mg/kg可以显著升高PINP大鼠MPWT。然而,事先腹腔注射Nrf2抑制剂葫芦巴碱20 mg/kg显著逆转了罗格列酮对PINP的缓解作用。此外,Nrf2和HO-1的表达在PINP大鼠脊髓中显著升高,而多次腹腔注射罗格列酮进一步上调PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表达水平,但这一效果被事先给予Nrf2抑制剂所阻断。免疫荧光结果与western blot结果一致。统计学分析所有数据采用均数±标准误表达,并用GraphPad Prism 5进行统计学分析。Western blot结果采用单因素方差分析,行为学结果采用双因素方差分析。p0.05认为差异具有统计学意义。研究总结1.主要研究结果1.1单次及多次腹腔注射PPARγ激动剂均显著升高PINP大鼠MPWT,且能被PPARγ拮抗剂所阻断;预防性腹腔注射PPARγ激动剂显著提高PINP大鼠在7 d及14d的MPWT,而对21 d的MPWT无显著影响;PINP大鼠脊髓PPARγ表达水平显著降低,而多次腹腔注射PPARγ激动剂显著上调PINP大鼠脊髓PPARγ的表达水平,但这一效果被事先给予PPARγ拮抗剂所阻断;PPARγ主要与神经元共表达,极少数与小胶质细胞及星形胶质细胞共表达。1.2单次及多次腹腔注射Nrf2激动剂均显著升高PINP大鼠MPWT,且能被Nrf2抑制剂所阻断;预防性腹腔注射Nrf2激动剂显著提高PINP大鼠在7 d的MPWT,而对14 d及21 d的MPWT无显著影响;PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1表达水平显著升高,而多次腹腔注射Nrf2激动剂进一步上调PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表达水平,但这一效果被事先给予Nrf2抑制剂所阻断;Nrf2及HO-1主要与神经元共表达,极少数与星形胶质细胞及小胶质细胞共表达。1.3单次腹腔注射PPARγ激动剂显著升高PINP大鼠MPWT,且能被Nrf2抑制剂所阻断;多次腹腔注射PPARγ激动剂进一步上调PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表达水平,但这一效果被事先给予Nrf2抑制剂所阻断。2.研究结论2.1 PPARγ激活可显著缓解已经存在的PINP,且可以延缓PINP的发生。2.2 Nrf2激活可显著缓解已经存在的PINP,且可以延缓PINP的发生。2.3 PPARγ通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解PINP。3.创新之处3.1首次证实PPARγ激动剂罗格列酮可以显著缓解PINP,并揭示PPARγ主要表达在脊髓神经元。3.2首次证实Nrf2激动剂奥替普拉可以有效缓解PINP,并揭示Nrf2及HO-1主要表达在脊髓神经元。3.3揭示了PPARγ激活缓解PINP的机制是激活脊髓神经元Nrf2/HO-1信号通路。4.展望4.1罗格列酮是临床上治疗II型糖尿病的常用药物。本研究发现罗格列酮可显著缓解大鼠PINP,然而罗格列酮能否改善患者的PINP仍需进一步的临床试验来证实。4.2奥替普拉曾被用于治疗血吸虫,现已被批准用于治疗肝纤维化和脂肪肝的III期临床试验。本研究发现奥替普拉可显著缓解大鼠PINP,然而奥替普拉能否改善患者的PINP仍需进一步的临床试验来证实。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741
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