CASC15、LMO1基因单核苷酸多态性与儿童神经母细胞瘤易感性的关联研究

发布时间：2020-07-23 16:23

【摘要】：背景神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一种起源于原始交感神经前体细胞的胚胎性肿瘤,是婴幼儿期最常见的颅外实体恶性肿瘤。交感神经系统的每个地方都能出现。至少一半的神经母细胞瘤出现在肾上腺髓质,其它常出现在颈部、胸部、腹部及盆腔的脊柱旁交感神经节。全世界范围内,占儿童肿瘤相关死亡的第三大原因。中国神经母细胞瘤发病率约百万分之7.7,占儿童肿瘤的10%。尽管治疗方法取得显著进展,但神经母细胞瘤的5年生存率仍低于40%,预后极差。因为经常并发慢性健康问题,幸存者生活质量会显著下降,并且给患儿家庭及社会带来沉重负担。神经母细胞瘤的发生发展过程复杂,具体病因尚不明确,目前认为其是遗传因素及环境因素共同作用的结果。神经母细胞瘤可分为家族型(2%)和散发型两组。家族型神经母细胞瘤的主要原因ALK受体酪氨酸激酶基因的功能获得性突变的发现,导致相同的体细胞突变和ALK作为一个易处理治疗靶点的快速发展。神经嵴发育的主要调整因子的失活性突变,PHOX2B,也被认为是家族型神经母细胞瘤的原因之一。其他高外显率的易感等位基因也可能存在,但这些遗传学突变总共占神经母细胞瘤的不足10%。散发型神经母细胞瘤具体病因仍不明确。通过对大样本的神经母细胞瘤病例的全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)发现了与该疾病相关的常见和罕见的基因多态性,使得明确神经母细胞瘤的基因机制变得可能。既往报道,主要在白种人和非洲人群实施的全基因组关联研究发现CASC15(6p22)、LMO1(11p15)、IL31RA(5q11.2)、DUSP12(1q23.3)、HSD17B12(11p11.2)、BARD1(2q35)、HACE1(6q16)、LIN28B(6q16)和DDX4(5q11.2)等9个基因的23个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)与神经母细胞瘤易感性显著相关,但针对中国汉族儿童人群的相关研究报道较少。此前研究报道中国广东汉族儿童人群CASC15、LMO1基因单核苷酸多态性与神经母细胞瘤易感性相关,本研究我们评估中国河南汉族儿童人群CASC15、LMO1基因单核苷酸多态性位点的改变与神经母细胞瘤发病风险的关系,并与广东汉族儿童人群进行联合分析,评估两个基因单核苷酸多态性与神经母细胞瘤发病风险的关系。目的通过对河南汉族儿童118例神经母细胞瘤患者和281例健康对照的CASC15基因三个单核苷酸多态位点rs9295536、rs4712653、rs6939340、及LMO1基因四个单核苷酸多态位点rs4758051、rs10840002、rs110419、rs204938进行分析,并与之前报道的中国广东汉族儿童人群数据进行联合分析,评估CASC15、LMO1基因单核苷酸多态性位点改变与中国两个不同地区汉族儿童神经母细胞瘤发病风险的相关性,进一步研究神经母细胞瘤发病的分子机制,期望为以后神经母细胞瘤的早期筛查、预防、危险程度分级、新型靶向治疗等方面提供理论依据。方法采集河南汉族儿童118例神经母细胞瘤患者的血液、石蜡病理标本作为病例组,采集同期体检的281例健康儿童的血液标本作为对照组,统计相关临床信息和人口学数据,提取DNA,采用Taq Man实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)进行基因分型,观察病例组及对照组CASC15、LMO1基因共7个SNPs的等位基因及基因型分布,χ2检验用来评估选择的单核苷酸多态位点是否符合Hardy-Weiberg平衡定律。双侧χ2检验用于比较神经母细胞瘤病例组和健康对照组的人口学变量和基因型频率。非条件logistic回归分析中OR(Odds ratios)值和95%置信区间(Confidence interval,CI)评估基因单核苷酸多态性位点与神经母细胞瘤发病风险的相关性。假阳性报道预测(FPRP)评估阳性结果的假阳性率。P0.05提示有显著性统计学差异。结果1.本研究显示河南汉族儿童人群中所选CASC15基因三个单核苷酸多态性位点分析表明在病例组及对照组中只有rs6939340 GA(AA vs.GG:adjusted OR=0.47,95%CI=0.23-0.98,P=0.045)与降低神经母细胞瘤发病风险显著相关,而CASC15基因rs4712653 CT和rs9295536AC与神经母细胞瘤发病风险无关。然而,此前研究报道广东汉族儿童人群中CASC15基因rs6939340 GA、rs4712653 CT和rs9295536AC均与降低神经母细胞瘤发病风险显著相关。通过联合两个群体进行共同研究发现CASC15基因rs6939340 GA(AG/AA vs.GG:adjusted OR=0.56,95%CI=0.44-0.72,P0.0001)、rs4712653 CT(CT/TT vs.CC:adjusted OR=0.65,95%CI=0.51-0.89,P=0.0009)和rs9295536AC(AC/CC vs.AA:adjusted OR=0.70,95%CI=0.54-0.90,P=0.0050)均与神经母细胞瘤发病风险降低显著相关,并且发现携带1-3个保护性等位基因(rs6939340 A、rs4712653 T、rs9295536 C)的人群较未携带者罹患神经母细胞瘤的风险显著降低(adjusted OR=0.65,95%CI=0.51-0.84,P=0.0007)。2.本研究发现河南汉族儿童人群中所选LMO1基因四个单核苷酸多态性位点分析表明在病例组及健康组中rs4758051 A等位基因(AA vs.GG:adjusted OR=0.28,95%CI=0.13 0.62,P=0.002;AG/AA vs.GG:adjusted OR=0.62,95%CI=0.40 0.97,P=0.035;AA vs.GG/AG:adjusted OR=0.33,95%CI=0.15 0.69,P=0.003)和rs10840002 G等位基因(AG vs.AA:adjusted OR=0.67,95%CI=0.51 0.88,P=0.004;GG vs.AA:adjusted OR=0.58,95%CI=0.40 0.84,P=0.004;AG/GG vs.AA:adjusted OR=0.65,95%CI=0.50 0.83,P=0.001)与降低神经母细胞瘤易感性显著相关,而LMO1 rs110419 AG、rs204938 AG与神经母细胞瘤易感性无关。此前针对广东汉族儿童人群研究报道只有LMO1 rs110419 G等位基因与较低的神经母细胞瘤发病风险显著相关,而LMO1 rs4758051 A、rs10840002 G、rs204938 G等位基因均与神经母细胞瘤发病风险无显著统计学差异。通过联合两个群体人群进行共同分析发现,LMO1 rs4758051 A(AA vs.GG:adjusted OR=0.57,95%CI=0.39 0.84,P=0.005;AA vs.GG/AG:adjusted OR=0.59,95%CI=0.41 0.84,P=0.004)、rs110419 G(AG vs.AA:adjusted OR=0.67,95%CI=0.51 0.88,P=0.004;GG vs.AA:adjusted OR=0.58,95%CI=0.40 0.84,P=0.004;AG/GG vs.AA:adjusted OR=0.65,95%CI=0.50 0.83,P=0.001)、rs10840002 G(GG vs.AA:adjusted OR=0.66,95%CI=0.46 0.95,P=0.026;GGvs.AG/AA:adjusted OR=0.68,95%CI=0.49 0.94,P=0.020)等位基因均与较低的神经母细胞瘤发病风险显著相关,LMO1 rs204938 G等位基因与神经母细胞瘤发病风险无显著统计学差异。结论1.CASC15基因rs6939340 GA、rs4712653 CT和rs9295536AC位点的多态性改变可能与中国汉族儿童神经母细胞瘤遗传易感性相关。2.LMO1基因rs110419 AG、rs4758051 GA、rs10840002 AG位点的多态性改变可能与中国汉族儿童神经母细胞瘤遗传易感性相关。3.本研究是首次对中国两个不同地域人群进行CASC15和LMO1基因多态位点分析,此结果仍有待于更大样本、多中心、不同种族人群的前瞻性病例对照研究来进行验证。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

TCTTACCATGGATAGATAGATATGTGTrs4712653 CAATATCTTTGCAGGATATTTTCTT(C/T)TGGTCTTGATTTCTATAGATGAGTrs9295536 CAAATGAATCCTTTCCATTGACTTT(A/C)AACTTGAATACAGCTCTCCCATCTTaqMan探针法原理如图1所示：针对待检测的SNP位点处于的核苷酸两条 PCR 引物和两条寡核苷酸探针，探针两段分别标记荧光淬灭基团告基团。模板 DNA 与探针结合位置把待检测的 SNP 位点覆盖。两条探针序列，在 SNP 位点位置的碱基是不同的，其它序列都是相同的。整，荧光淬灭基团可吸收荧光报告基团发射的荧光信号，对其进行实CR 扩增，该探针和模板之间出现退火反应，然后与探针 5’端相连的荧 Taq 酶切下，游离的荧光报告基团发射出荧光信号，PCR 产物形成和累积两者同步进行。依据不同的荧光颜色，系统识别出待检测 SNP 位是纯合突变型、纯合野生型或者杂合型。

图 2.6.3 质量控制为控制基因分型质量，在 384 孔板各个检测单元中随机设 4 个阳性对照 个阴性对照，加入重复的 DNA 样本为阳性对照，加入等量的双蒸水为阴性。在图像横轴及纵轴上，各个 SNP 的信号强度均应形成三个明显的簇。分合率达到 100%，各个 SNP 分型成功率达到 100%。.7 统计分析.7.1 数据处理运用 SAS 软件（Version 9.1; SAS Institute, Cary, NC, USA）对数据进行统析，拟合优度的χ2检验评估对照组选择的单核苷酸多态位点是否符ardy-Weinberg 平衡定律。双侧χ2检验分析处理神经母细胞瘤病例组与健康对的人口学变量和基因型频率。非条件 logistic 回归分析中 OR（Odds Ratio） 95%置信区间（CI）评估 SNP 与神经母细胞瘤易感性的关联性。假阳性报测（FPRP）评估阳性结果的假阳性率。P< 0.05 表示差异有显著统计学意义

综 述4 散发型神经母细胞瘤的遗传易感性在家族性神经母细胞瘤中，有罕见的突变导致疾病的可能性很高。对于散发的 99％病例，一个常见的变异假设提出常见的种系变异影响疾病发生的可能性，每种疾病都有相对低的风险，但大概是一致的。一项纳入 720 个神经母细胞瘤病例和2128个健康对照的大样本GWAS被认为是发现这些多态性的一种无偏倚的方法（图 2）[89]。随着额外的病例样本不断积累，最初的 GWAS 已经被扩展和重复验证，从而发现与高风险和低风险的神经母细胞瘤易感性显著相关DNA 等位基因，包括 CASC15，BARD1，LMO1，LIN28B，HACE1，DUSP12，DDX4 ， IL31RA ， HSD17B12 ， NEFL ， TP53 和 NBPF23 （ 表 1 ）[72,74，75,79,81,88,89,102,103,104,107]。这些易感性位点的发现证实了 GWAS 信号可以作为线索揭示基础生物学驱动神经母细胞瘤的发病。

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