【摘要】：目的:探讨托法替尼(tofacitinib)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠的防治作用及其免疫学机制,为托法替尼治疗多发性硬化(multiple sclerosis,MS)寻找理论依据。方法:选择50只Wistar雌性大鼠,随机分为正常对照组、EAE对照组、托法替尼小、中、大剂量防治组,每组10只,采用髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)及完全弗氏佐剂制(complete freud's adjuvant,CFA)注入EAE对照组及托法替尼大、中、小剂量防治组大鼠双侧后肢足掌皮下(0.2ml/100g)造EAE模型,正常对照组给予等量生理盐水+CFA,造模后当天及第2日,分别给各组大鼠腹腔注射百日咳素(pertussis toxin,PTX)(0.2ml/只)加强免疫反应。从造模前3天开始,小、中、大剂量托法替尼防治组分别予以生理盐水和托法替尼1、2、4 mg/(kg·d)(2ml注射用生理盐水溶解)灌胃,EAE对照组和正常对照组均灌胃等量生理盐水,连续10天。将连续3天症状评分无加重、四肢瘫痪或死亡作为各组大鼠发病高峰期,在发病高峰期处死大鼠,未发病大鼠观察8周后处死。保留大鼠下腔静脉血、脑组织及脾脏。观察大鼠发病情况(发病潜伏期、进展期及高峰期神经功能障碍评分变化);观察各组发病大鼠脑组织基本病理改变;通过免疫组织化学法,采用抗胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)检测各组大鼠脑组织内的星型胶质细胞活化情况,用髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体染色标记各组大鼠脑白质内的髓鞘,观察其脱失情况;流氏细胞仪检测各组大鼠脾脾组织中Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+T细胞群)比例和Tfr(CD4+Foxp3+CXCR5+ICOS+T细胞群)比例、Tfr/Tfh比值变化;酶联免疫吸附法(ELISA法)检测大鼠脑组织匀浆中CXCL13、TGF-β1含量变化;ELISA法检测外周血IL-10、IL-21含量变化;7、将EAE对照组及托法替尼各剂量防治组发病高峰期临床表现与发病高峰期免疫学指标进行相关性分析。结果:(1)临床表现:正常对照组大鼠未发病,EAE对照组全部发病,小、中、大剂量托法替尼防治组大鼠发病率分别是90%、60%、40%。发病大鼠多于造模后第10-12天开始出现精神萎靡,体重减轻,活动及食量减少等,此后病情逐渐加重,于造模后第15-20天达疾病高峰:表现为极度衰弱消瘦、单后肢或双后肢无力拖地、共济失调、瘫痪甚至死亡。①潜伏期:托法替尼各防治组发病潜伏期均较EAE对照组延长,剂量越大,潜伏期延长越明显,中、大剂量托法替尼防治组发病潜伏期较小剂量托法替尼防治组延长,大剂量托法替尼防治组发病潜伏期较中剂量托法替尼防治组延长,差异具有统计学意义(P0.01);②进展期:托法替尼各防治组发病进展期均较EAE对照组缩短,中、大剂量托法替尼防治组发病进展期较小剂量托法替尼防治组缩短,大剂量托法替尼防治组发病进展期较中剂量托法替尼防治组缩短,差异具有统计学意义(P0.01)。③高峰期神经功能障碍评分:托法替尼各防治组发病高峰期神经功能障碍评分均较EAE对照组降低,差异有统计学意义(P0.01),中、大剂量托法替尼防治组发病高峰期神经功能障碍评分较小剂量托法替尼防治组低,差异有统计学意义(P0.01、P0.05),大剂量托法替尼防治组发病高峰期神经功能障碍评分较中剂量托法替尼防治组低,但差异不具有统计学意义(P0.05)。(2)脑组织病理改变:正常对照组大鼠脑组织无炎性细胞浸润;EAE对照组及托法替尼各剂量防治组大鼠脑组织内可见大量炎性细胞环绕血管周围。但与EAE对照组比较,托法替尼各剂量组大鼠脑组织病理评分均下降,炎性细胞浸润下降,差异有统计学意义(P0.01);且以大剂量托法替尼组炎症细胞浸润程度减轻最明显,各剂量组间差异具有统计学意义(P0.01、P0.05)。(3)脑组织免疫组化结果(1)星型胶质细胞活化情况:正常对照组大鼠脑组织内未见GFAP阳性细胞表达;EAE对照组大鼠脑组织内弥漫分布活化的星形胶质细胞;与EAE对照组相比,托法替尼各剂量组脑组织GFAP阳性细胞平均IOD值显著减少,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼小剂量组比较,托法替尼大、中剂量组脑组织GFAP阳性细胞平均IOD值明显减少,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼中剂量组比较,托法替尼大剂量组脑组织GFAP阳性细胞平均IOD值显著减少,差异有统计学意义(P0.01)。(2)髓鞘脱失变化:正常对照组大鼠脑组织内未见明显髓鞘脱失,而EAE对照组、托法替尼各剂量防治组脑组织中髓鞘脱失明显,MBP染色阳性表达IOD值较正常对照组显著降低,差异有统计学意义(P0.01);托法替尼各剂量防治组脑组织MBP染色阳性表达IOD值较EAE对照组皆显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼小剂量防治组相比,托法替尼大、中剂量防治组脑组织MBP阳性表达IOD值显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组脑组织MBP阳性表达IOD值明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。(4)大鼠脾组织Tfh细胞比例、Tfr细胞比例、Tfr/Tfh比值变化:(1)Tfh细胞比例:与正常对照组相比,EAE对照组脾组织Tfh细胞比例显著升高,差异有统计学意义(P0.01),与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组大鼠脾组织中Tfh细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼小剂量防治组相比,托法替尼大、中剂量防治组大鼠脾组织Tfh细胞比例显著下降,差异有统计学意义(P0.01、P0.05),与托法替尼中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组大鼠脾组织Tfh细胞比例显著下降,差异有统计学意义(P0.01)。(2)Tfr细胞比例:与正常对照组相比,EAE对照组脾组织Tfr细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P0.01、P0.05),与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组大鼠脾组织中Tfr细胞比例显著升高,差异有统计学意义(P0.01、P0.05);与托法替尼小剂量防治组相比,托法替尼大、中剂量防治组大鼠脾组织Tfr细胞比例显著上升,差异有统计学意义(P0.01),与托法替尼中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组大鼠脾组织Tfr细胞比例显著上升,差异有统计学意义(P0.05)。(3)脾组织Tfr/Tfh比值变化:与正常对照组相比,EAE对照组脾组织Tfr/Tfh比值显著降低,差异有统计学意义(P0.05);与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组大鼠脾组织中Tfr/Tfh比值显著升高,差异有统计学意义(P0.05);与托法替尼小剂量防治组比较,托法替尼大、中剂量防治组大鼠脾组织Tfr/Tfh比值显著上升,差异有统计学意义(P0.05);与托法替尼中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组大鼠脾组织Tfr/Tfh比值显著上升,差异有统计学意义(P0.05)。(5)脑组织匀浆中CXCL13、TGF-β1含量变化:(1)CXCL13含量变化:与正常对照组相比,EAE对照组、托法替尼各防治组大鼠脑组织匀浆CXCL13水平明显升高,差异有统计学意义(P0.01);与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组大鼠脑组织匀浆中CXCL13水平均显著降低,差异有统计学意义(P0.01、P0.05);与托法替尼小剂量防治组相比,托法替尼大、中剂量防治组脑组织匀浆中的CXCL13水平明显降低,差异有统计学意义(P0.01、P0.05);与托法替尼中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组脑组织匀浆中的CXCL13水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。(2)TGF-β1含量变化:与正常对照组相比,EAE对照组、托法替尼各剂量防治组大鼠脑组织匀浆TGF-β1水平明显降低,差异有统计学意义(P0.01);与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组大鼠脑组织匀浆TGF-β1水平均显著升高,差异有统计学意义(P0.01、P0.05);与托法替尼,小剂量防治组相比,托法替尼大、中剂量防治组大鼠脑组织匀浆中TGF-β1水平明显上升,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼,中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组大鼠脑组织匀浆中TGF-β1水平明显上升,差异有统计学意义(P0.01)。(6)血清中IL-21、IL-10含量变化:(1)IL-21含量变化:与正常对照组相比,EAE对照组、托法替尼各剂量防治组大鼠血清中IL-21含量明显升高,差异有统计学意义(P0.01);与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组血清中IL-21含量显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼小剂量防治组比较,托法替尼大、中剂量防治组血清中IL-21含量明显降低,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼中剂量防治组比较,托法替尼大剂量防治组血清中IL-21含量明显降低,差异有统计学意义(P0.01)。(2)IL-10含量变化:与正常对照组相比,EAE对照组、托法替尼各防治组大鼠血清中IL-10含量显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与EAE对照组相比,托法替尼各剂量防治组血清中IL-10含量显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼小剂量防治组相比,托法替尼大、中剂量防治组血清中的IL-10水平明显升高,差异有统计学意义(P0.01);与托法替尼中剂量防治组相比,托法替尼大剂量防治组血清中的IL-10水平明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。(7)相关性分析:(1)EAE对照组及托法替尼各剂量组大鼠发病潜伏期与脾组织Tfr细胞比例、Tfr/Tfh比值、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清IL-10水平的呈正相关(P0.01);与脾组织Tfh细胞比例、脑组织匀浆中CXCL13含量及血清IL-21水平呈负相关(P0.01)。(2)EAE对照组及托法替尼各剂量组大鼠发病进展期与脾组织Tfh细胞比例、脑组织匀浆中CXCL13含量及血清IL-21水平呈正相关(P0.01);与脾组织Tfr细胞比例、Tfr/Tfh比值、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清IL-10水平的呈负相关(P0.01)。(3)EAE对照组及托法替尼各剂量组大鼠发病高峰期神经功能障碍评分与脾组织Tfh细胞比例、脑组织匀浆中CXCL13含量及血清IL-21水平呈正相关(P0.01);与脾组织Tfr细胞比例、Tfr/Tfh比值、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清IL-10水平的呈负相关(P0.01、P0.05)。结论:(1)Wistar大鼠通过注入豚鼠脊髓匀浆可以成功诱导EAE模型,促使EAE大鼠发病,明显增加发病大鼠脑组织内炎性细胞的浸润程度。(2)EAE大鼠存在Tfh细胞比例升高、Tfr细胞比例下降、Tfr/Tfh比值失衡,发病高峰期CXCL-13及IL-21含量明显升高、TGF-b1、IL-10含量明显降低,免疫平衡向Tfh细胞漂移。(3)托法替尼可延长EAE大鼠发病潜伏期、缩短进展期、降低神经功能障碍评分,同时减轻脑组织炎细胞浸润、抑制星型胶质细胞活化及髓鞘脱失的病理损害,从而对EAE发病具有防治作用,且剂量越大,防治作用越明显。(4)托法替尼对EAE大鼠发病的防治作用机制可能与下调EAE大鼠Tfh细胞比例及CXCL-13、IL-21的表达、上调Tfr细胞比例及TGF-b1、IL-10的表达、维持Tfr/Tfh平衡并促使平衡向Tfr偏移有关。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.51
【图文】：
comparison (day)1.2 EAE 对照组及托法替尼各防治组大鼠病潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分比较（见表2 ，图1.1-1.3 ）
图1.2：EAE对照组及托法替尼各防治组发病进展期比较（天）re1.2: EAE control group and tofacitinib treatment group the incidadvanced comparison (day)EAE 对照组及托法替尼各防治组发病高峰期神经功能障碍评e1.3: EAE control group and tofacitinib treatment group peak incid
EAE 对照组及托法替尼各防治组发病高峰期神经功能障碍评1.3: EAE control group and tofacitinib treatment group peak incidneurological dysfunction score (point)示：托法替尼各防治组发病潜伏期均较 EAE 对照组替尼防治组发病潜伏期较小剂量托法替尼防治组延治组发病潜伏期较中剂量托法替尼防治组延长，差<0.01）；托法替尼各防治组发病进展期均较 EAE 对托法替尼防治组发病进展期较小剂量托法替尼防治尼防治组发病进展期较中剂量托法替尼防治组缩短（P<0.01）。托法替尼各防治组发病高峰期神经功
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