高尔基体膜蛋白GOLM1在胶质母细胞瘤恶性生物学行为中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-24 12:44

【摘要】：研究背景在所有原发恶性脑肿瘤中,胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM,WHO IV)约占45-50%。尽管采取最大安全范围手术切除,辅以放射治疗及替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)为主的化疗,胶质母细胞瘤患者的中位生存期也仅为12-15个月。肿瘤细胞向周围脑组织弥漫浸润及快速增殖是胶质母细胞瘤预后不良及复发的重要原因。虽然研究表明,脑内特殊的细胞外基质构造、细胞黏附相关表面受体以及侵袭细胞中多种信号通路的激活是胶质母细胞瘤浸润侵袭的主要病理基础,但尚无可靠手段能够有效逆转这些异常改变。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是肿瘤恶性增殖方面的代表性治疗靶点。然而,针对EGFR的小分子抑制剂,如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib),依然无法显著延长胶质母细胞瘤患者的无进展生存期。针对热休克蛋白家族及细胞周期蛋白等靶点的抗增殖药物的治疗效果尚有待评估。由此可见,仍需继续探索胶质母细胞瘤增殖及侵袭迁移的内部机制,以求通过新方法、新理念改变其治疗窘境。研究表明,高尔基体相关蛋白可参与调控胶质母细胞瘤的恶性进展。例如,高尔基体磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)异常高表达显著促进胶质母细胞瘤增殖、侵袭迁移并预示患者预后不良。高尔基体膜蛋白11(Golgi membrane protein 1,GOLM1),又名GOLPH2或GP73,是位于高尔基体顺面及中间膜囊的高度磷酸化蛋白。GOLM1主要参与内质网蛋白合成后修饰并协助高尔基体完成蛋白转运与分泌。近年来,GOLM1在人类肿瘤中的作用被逐渐揭示。据文献报道,GOLM1能够作为癌基因促进肝癌细胞增殖、侵袭迁移,且己被确定为肝癌的血清学诊断标志物。此外,GOLM1还与前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、食管癌等多种人类常见肿瘤的恶性进展密切相关。然而,GOLM1在胶质母细胞瘤增殖及侵袭迁移中的作用仍有待阐明。对肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)内的大量胶质母细胞瘤病例进行基因聚类分析发现,胶质母细胞瘤可以依据特异性的分子标志物分为4个亚型,包括经典型、间充质型、前神经元型、神经元型。该研究为以分子分型为导向的胶质母细胞瘤个性化治疗奠定了基础。作为前神经元型胶质母细胞瘤分子标志物,血小板衍生生长因子受体α(Platelet-derived growth factor receptor α,PDGFRα)及其配体血小板衍生生长因子A(Platelet-derived growth factor subunit A,PDGFA)可通过自分泌和旁分泌两种途径促进胶质母细胞瘤恶性进展。在肝癌细胞系Huh7中的一项研究表明,PDGF能够刺激GOLMl的表达,而GOLM1作为关键蛋白参与PDGF对下游效应分子的调控。然而,GOLM1与PDGFA/PDGFRα在胶质母细胞瘤中的相互关系以及GOLM1在前神经元型胶质母细胞瘤中的潜在治疗意义仍不明确。基于以上研究现状,本课题拟通过qRT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光、慢病毒转染、EdU、CCK-8、3D肿瘤球体侵袭实验、肿瘤相关磷酸激酶抗体芯片、裸鼠颅内及皮下肿瘤模型等技术,探讨GOLMl在胶质母细胞瘤中的功能及机制,明确GOLM1与PDGFA/PDGFRα信号通路间的相互关系,进而为胶质母细胞瘤的治疗提供新的理论依据。第一部分GOLM1在胶质瘤中的表达及亚细胞定位目的检测GOLMl在正常脑组织、胶质瘤组织、正常人星形胶质细胞(Normal human astrocyte,NHA)及胶质母细胞瘤细胞系中的表达水平,初步分析GOLM1在胶质母细胞瘤细胞中的分布。方法1.使用qRT-PCR、免疫组化、Western blot,分析正常脑组织、不同级别胶质瘤组织中GOLM1的表达。2.使用qRT-PCR和Western blot,检测NHA和胶质母细胞瘤细胞系(U87MG、U251、A172)中 GOLM1 的表达。3.使用免疫荧光及细胞骨架染色,观察GOLM1在U87MG和U251细胞中的分布。结果1.GOLM1在胶质瘤组织中呈病理级别依赖性升高。qRT-PCR、免疫组化及Western blot结果表明,GOLM1在正常脑组织中的表达普遍较低,在低级别胶质瘤组织(WHO Ⅱ)和高级别胶质瘤组织(WHO Ⅲ-)中依次升高。2.GOLM1在胶质母细胞瘤细胞核周围集中表达。qRT-PCR及Western blot检测结果显示,U251和A172细胞中GOLM1的表达明显高于NHA和U87MG细胞。免疫荧光及细胞骨架染色发现,U87MG和U251细胞的GOLM1蛋白主要分布于细胞核周围胞浆中,这与高尔基体在多种细胞中的定位相符。结论1.GOLM1在胶质瘤组织中呈病理级别相关性表达升高。2.GOLM1在胶质母细胞瘤细胞中呈核周胞浆表达。第二部分GOLM1在胶质母细胞瘤增殖与侵袭迁移中的作用及机制目的探究GOLM1在胶质母细胞瘤增殖与侵袭迁移中的作用及内在机制。方法1.利用EdU、CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞活力检测实验、克隆形成实验,检测敲减或过表达GOLM1后胶质母细胞瘤细胞增殖的改变。2.利用Transwell实验,检测敲减或过表达GOLM1后胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移的改变。3.利用CCK-8和3D肿瘤球体侵袭实验,检测敲减GOLM1后原代细胞P3#GBM增殖和侵袭的改变。4.利用裸鼠颅内原位及皮下种植瘤模型,验证GOLM1在胶质母细胞瘤增殖及侵袭中的意义。5.利用磷酸激酶抗体芯片及Western blot,探究GOLM1促进胶质母细胞瘤增殖及侵袭迁移的分子通路。6.利用CCK-8、EdU、Transwell实验,探究AKT磷酸化在GOLM1所促进的胶质母细胞瘤恶性行为中的意义。结果1.敲减GOLM1抑制U251和A172细胞增殖和侵袭迁移。qRT-PCR及Western blot结果显示,整合GOLM1 短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒能在U251和A172细胞中高效下调GOLM1。EdU、CCK-8及克隆形成实验结果表明,敲减GOLM1能够明显抑制U251和A172细胞增殖。此外,我们在光镜下发现,敲减GOLM1引起U251和A172的细胞形态由长梭形向短圆形改变,提示细胞运动能力改变的可能性。Transwell实验结果证实,敲减GOLM1可显著抑制U251和A172细胞侵袭、迁移。2.敲减GOLM1抑制U251源性胶质母细胞瘤进展。颅内模型研究表明,GOLM1敲减组小鼠生存期较对照组明显延长,而肿瘤大小及微侵袭灶数量均低于对照组。人源细胞标志物TRA1-85/CD147免疫荧光发现,正常脑组织中的微侵袭灶均来源于肿瘤核心团块,说明敲减GOLM1抑制核心区域肿瘤细胞向周围组织浸润。免疫组化结果显示,GOLM1敲减组小鼠肿瘤组织中Ki-67的表达明显低于对照组。此外,我们在皮下肿瘤模型中发现,GOLM1敲减组小鼠肿瘤体积、重量均显著低于对照组,初步表明敲减GOLM1能抑制U251源性胶质母细胞瘤进展。3.敲减GOLM1抑制P3#GBM细胞增殖与侵袭。CCK-8、3D肿瘤球体侵袭实验结果证明,敲减GOLM1显著抑制P3#GBM细胞增殖与侵袭。在颅内模型中,GOLM1敲减组小鼠术后生存期较对照组明显延长,而肿瘤生长与侵袭均受到明显抑制。在皮下模型中,GOLM1敲减组小鼠肿瘤的体积和重量普遍低于对照组,提示敲减GOLM1显著抑制P3#GBM源性胶质母细胞瘤进展。4.过表达GOLM1促进U87MG细胞增殖和侵袭迁移。qRT-PCR及Western blot结果显示,整合GOLM1过表达质粒的慢病毒能够在U87MG细胞中显著上调GOLM1。EdU、CCK-8、克隆形成实验结果显示,过表达GOLM1显著促进U87MG细胞增殖。光镜下,与对照组相比,过表达GOLM1的U87MG细胞形态较狭长且与周围细胞连接更为紧密。Transwell实验结果证明,上调GOLM1显著增强U87MG细胞的侵袭迁移。体内实验中,过表达GOLM1能够明显缩短荷瘤鼠生存期并促进颅内肿瘤生长与侵袭。与此相符地,过表达GOLM1组小鼠皮下肿瘤体积与重量均明显高于对照组,表明上调GOLM1能够加速U87MG源性胶质母细胞瘤进展。5.GOLM1通过激活AKT促进胶质母细胞瘤增殖及侵袭迁移。肿瘤相关磷酸激酶抗体芯片结果发现,敲减GOLM1能够引起多种肿瘤相关激酶磷酸化的改变。根据在胶质母细胞瘤中的重要性及后续Western blot检测结果,我们推测AKT磷酸化是GOLM1促癌的潜在驱动力。此外,AKT下游蛋白与GOLM1在表达水平上具有一致性。AKT磷酸化抑制剂MK-2206能够在较大程度逆转GOLM1过表达所致的胶质母细胞瘤增殖和侵袭迁移,提示AKT激活在GOLM1促癌过程中扮演关键角色。结论GOLM1能够激活AKT促进胶质母细胞瘤增殖与侵袭迁移。第三部分胶质母细胞瘤中GOLM1与PDGFA/PDGFRα信号通路的相互关系目的揭示GOLM1与PDGFRα的关联,探究PDGFA/PDGFRα对GOLM1的调控,发掘GOLM1在PDGFA/PDGFRα介导下游信号通路激活及胶质母细胞瘤恶性行为中的潜在作用。方法1.借助TCGA及Rembrandt数据库,探究GOLM1在不同亚型胶质瘤中的表达及其与PDGFRα的关联。2.应用免疫组化,在本单位标本库中的胶质母细胞瘤样本中探究GOLM1与p-PDGFRα的关联。3.应用 qRT-PCR、免疫荧光、Western blot,探究PDGFA/PDGFRαa对GOLM1的调控。4.应用 EdU、Transwell实验、Western blot,探究GOLM1 在PDGFA/PDGFRαa信号通路中的作用。结果1.GOLM1与PDGFRα的表达和激活相关。分析TCGA中不同亚型的胶质瘤病例发现,GOLM1在前神经元型胶质瘤中的表达最高。而后,我们在TCGA、Rembrandt数据库胶质瘤样本中发现,GOLM1与PDGFRα的表达呈正相关。此外,对本单位标本库中的胶质母细胞瘤样本进行免疫组化发现,GOLM1与p-PDGFRα的表达同样正相关,提示GOLM1的表达可能与PDGFRa的磷酸化激活有关,进一步揭示GOLM1与前神经元型胶质母细胞瘤存在潜在关联。2.PDGFA/PDGFRa参与调控A172细胞中GOLM1的表达。我们首先通过Western blot测试U251和A172细胞对外源性PDGFA刺激的反应性。接受等剂量PDGFA刺激后,A172细胞中p-PDGFRα的上调显著高于U251细胞。而后,我们通过qRT-PCR、免疫荧光、Western blot检测发现,在A172细胞中,外源性PDGFA能够在mRNA、蛋白水平上调GOLM1,且呈浓度依赖性。PDGFRα自磷酸化抑制剂AG1296能较大程度地阻断PDGFA对GOLM1的诱导,提示GOLM1的刺激上调依赖于PDGFRα的激活。3.GOLM1是PDGFA/PDGFRα信号调控胶质母细胞瘤恶性行为的关键蛋白。EdU及Transwell实验结果表明,外源性PDGFA能够显著增强A172细胞的增殖及侵袭迁移能力,而这种刺激作用在敲减GOLM1后则变得较为微弱。Western blot结果表明,敲减GOLM1能够部分破坏PDGFA/PDGFRα信号通路对下游效应分子的激活,提示GOLM1可能是PDGFA/PDGFRα信号传导过程中的关键蛋白。结论1.GOLM1与胶质瘤组织中PDGFRαa的表达和激活相关。2.PDGFA/PDGFRα参与诱导胶质母细胞瘤细胞中GOLM1的表达。3.GOLM1在PDGFA/PDGFRα介导的下游效应分子激活、胶质母细胞瘤增殖及侵袭迁移中具有重要作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

胶质瘤,依赖性,胶质母细胞瘤,细胞骨架

Ｕ８７ＭＧ逦Ｕ２５１逡逑图１－２．邋ＧＯＬＭｌ在胶质母细胞瘤细胞核周围集中表达。使用ｑＲＴ－ＰＣＲ邋（Ａ）和逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ（Ｂ）检测邋ＮＨＡ、Ｕ８７ＭＧ、Ａ１７２、Ｕ２５１邋细胞中邋ＧＯＬＭｌ邋的表达。（Ｃ）逡逑Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１细胞中ＧＯＬＭ１免疫荧光及细胞骨架染色的典型图。ＧＯＬＭ１被逡逑３７逡逑

统计图,胶质母细胞瘤,细胞核,胶质瘤

逦ＷＨＯ邋ＩＶ逡逑ｉｒ；；邋－邋？逡逑图１－１．邋ＧＯＬＭｌ在胶质瘤组织中呈病理级别依赖性升氋。（Ａ）使用ｑＲＴ－ＰＣＲ检逡逑测正常脑组织、胶质瘤组织中ＧＯＬＭ１的表达水平。（Ｂ）对正常脑组织、胶质瘤逡逑组织中的ＧＯＬＭ１进行免疫组化染色的典型图。比例尺为２０0ｎｍ。（Ｃ）免疫组化逡逑染色评分统计图。（＊＊Ｐ＜邋０．０１，＊＊＊Ｐ＜邋０．００１）逡逑Ａ邋５１逦Ｂ逡逑ＧＯＬＭ１逡逑■邋■邋逦逡逑１邋１＂邋ｒ￣１邋ｎ＾ｌ逦ＧＡＰＤＨ邋ＭＰ邋ｍｔｍ邋＿■＿＞逡逑Ｃ邋鲁ｗｎ逦Ｗ逦鲁ＤＡＰ丨逡逑Ｕ８７ＭＧ逦Ｕ２５１逡逑图１－２．邋ＧＯＬＭｌ在胶质母细胞瘤细胞核周围集中表达。使用ｑＲＴ－ＰＣＲ邋（Ａ）和逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ（Ｂ）检测邋ＮＨＡ、Ｕ８７ＭＧ、Ａ１７２、Ｕ２５１邋细胞中邋ＧＯＬＭｌ邋的表达。（Ｃ）逡逑Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１细胞中ＧＯＬＭ１免疫荧光及细胞骨架染色的典型图。ＧＯＬＭ１被逡逑３７逡逑

胶质瘤,依赖性,胶质母细胞瘤,细胞骨架

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