ApoE靶向还原敏感纳米囊泡载阿霉素治疗脑胶质瘤的实验研究

发布时间：2020-07-27 14:54

【摘要】：脑胶质瘤是最常见的中枢系统恶性肿瘤,目前的治疗原则是:在手术治疗的基础上,联合放疗和化疗。胶质瘤化疗的最大难题就是如何让药物穿越血脑屏障(BBB)到达肿瘤部位发挥作用。基于新型含硫硫五元环的环状碳酸酯单体(DTC)和三亚甲基碳酸酯(TMC)的共聚物PEG-P(TMC-DTC)具有良好的生物相容性和还原响应性,有望成为一种高效的药物递送载体。我们在研究中发现蛋白多肽ApoE能较好地靶向到BBB和胶质瘤细胞共表达的LRP1受体上,故选择ApoE作为靶向分子。目前胶质瘤的临床一线用药为替莫唑胺(TMZ),由于多形性胶质母细胞瘤(GBM)对TMZ的耐药性,大多数GBM患者(60-75%)不能从TMZ治疗中获益,研发新型药物用于胶质瘤患者的治疗迫在眉睫。基于这一临床问题,本课题组成功构建了一种新型靶向脑胶质瘤的囊泡纳米载药体系,并在体内外实验验证了其治疗胶质瘤的疗效。结果表明采用PEG-P(TMC-DTC)两嵌段聚合物作为纳米载体包裹化疗药物阿霉素(DOX)以制备成囊泡纳米药物,可使DOX穿越BBB到达肿瘤部位进行释放,达到治疗胶质瘤的目的。第一部分:生物可降解及还原敏感囊泡纳米粒的制备和表征目的:以蛋白多肽ApoE作为靶向分子,以PEG-P(TMC-DTC)作为纳米载体,包裹阿霉素DOX制备成稳定的具有还原响应的囊泡纳米粒。方法:首先通过加成反应将ApoE分子修饰到PEG-P(TMC-DTC)聚合物上。将ApoE-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)聚合物以10 mg/m L的浓度用DMF溶液溶解好后,将两种聚合物按适当的比例滴入柠檬酸缓冲液中(pH 4,10 mM),置于37℃静置1-2小时。待囊泡溶液呈均一的泛蓝光状,用饱和的Na_2HPO_4溶液将囊泡溶液的pH调至7.8,约3秒后滴入DOX溶液,搅拌5-10min。静置过夜自交联,最后于室温下在PB(pH 7.4,10 mM)中透析6-8小时。制备好囊泡纳米粒后,用DLS仪检测纳米粒的粒径、粒径分布(PDI)和不同条件(稀释100倍、10%FBS、放置一周)纳米粒的稳定性以及在10 mM GSH条件下的还原响应性。并用紫外分光光度计检测纳米粒中DOX的包封效率和载药量。结果:本研究构建的纳米囊泡粒径约80 nm,且不同ApoE靶向比例对纳米粒的粒径和粒径分布没有明显影响。载DOX对不同ApoE靶向比例纳米粒(ApoE:0、10、20、30%)的粒径和粒径分布的影响不大。在10%的FBS、100倍及200倍稀释、放置1周的条件下,纳米粒ApoE20-PS的粒径及PDI都没有发生太大的变化,提示我们的纳米粒相对稳定。在没有GSH的条件下,纳米粒放在摇床中摇晃24h,粒径及PDI没有明显变化;而在10 mM GSH的条件下,12h后纳米粒已经开始溶胀使粒径增大,到24h后纳米粒完全溶胀,粒径明显增大至1000多纳米,提示纳米粒已经发生响应。我们从载药囊泡纳米粒释放实验观察到,在24小时内,还原条件下PS-DOX和ApoE-PS-DOX分别释放了70%和83%,而生理条件下只释放了16%和21%。结论:本研究制备了一种具有脑胶质瘤靶向前景的囊泡纳米药物ApoE20-PS-DOX,该纳米药物具有很好的稳定性和还原响应性,而且在还原环境下DOX能高效释放。第二部分:生物可降解及还原敏感囊泡纳米粒的体外生物活性检测目的:对构建的新型囊泡纳米粒药物ApoE20-PS-DOX的体外生物活性进行评价,以检测其生物相容性及对胶质瘤细胞的细胞毒性及靶向性。方法:以MTT法检测聚合物浓度在0.1-0.5mg/mL时PS、ApoE-PS对U87及正常胶质细胞的毒性,以评估其生物安全性。以Annexin V-FITC/7AAD法检测囊泡纳米粒药物ApoE20-PS-DOX、Lipo-DOX、PS-DOX对U87细胞凋亡的影响,并用WB实验探索相关的分子机制。以Transwell实验检测囊泡纳米粒药物ApoE20-PS-DOX、Lipo-DOX、PS-DOX对U87细胞侵袭的影响。以FACS实验检测Lipo-DOX、PS-DOX及不同ApoE靶向比例囊泡纳米粒药物ApoE-PS-DOX的内吞效果;用CLSM实验检测囊泡纳米粒药物ApoE20-PS-DOX、Lipo-DOX、PS-DOX内吞和细胞内释放情况。结果:1、在U87细胞中,纳米囊泡药物ApoE10-PS-DOX、ApoE20-PS-DOX、ApoE30-PS-DOX、PS-DOX、Lipo-DOX的IC50分别为:1.7、1.0、1.8、3.6、10.2μg/ml,ApoE20-PS-DOX能够引起最显著的细胞毒性;2、在纳米囊泡药物ApoE-PS-DOX中,ApoE20-PS-DOX组对U87细胞靶向效果最好,其靶向效果是Lipo-DOX 5倍;3、纳米囊泡药物PS-DOX引起约40%细胞凋亡,ApoE-PS-DOX引起约80%细胞凋亡,且ApoE20-PS-DOX促凋亡作用最明显;4、Transwell实验观察到ApoE20-PS-DOX组抑制U87细胞侵袭的作用最为明显,强于PS-DOX组及Lipo-DOX组。结论:新型脑靶向囊泡纳米药物ApoE-PS-DOX具有一定的脑胶质瘤靶向性,且在ApoE比例为20%时,对胶质母细胞瘤U87细胞的靶向效果最佳;该囊泡纳米药物能明显促进U87细胞凋亡并抑制其侵袭。第三部分:生物可降解及还原敏感囊泡纳米粒的体内生物活性检测目的:对新型囊泡纳米粒药物ApoE20-PS-DOX的体内生物活性进行评价,检测囊泡纳米药物DOX的生物分布、血液循环时间,探索对原位脑胶质瘤模型的治疗效果及机制。方法:1、血液循环实验:检测不同载药纳米粒注射到荷瘤裸鼠后,在血液中的循环时间;2、生物分布实验:检测不同载药纳米粒注射到荷瘤裸鼠后,不同器官及肿瘤部位DOX·HCl的分布情况;3、药物耐受量实验:摸索裸鼠对DOX的耐受情况;4、活体成像实验监测治疗过程中颅内肿瘤变化;5、HE染色评估肿瘤治疗效果和对心脏毒性;6、Tunel法检测肿瘤细胞内凋亡情况。结果:1、从血液循环实验中:我们观察到Lipo-DOX的半衰期约为8.2小时,DOX经过我们的囊泡纳米粒包裹之后循环时间由0.2小时延长至3.9小时;2、从生物分布实验中:我们观察到在脑肿瘤部位富集:ApoE20-PS-DOX组是PS-DOX组的4.8倍,体现出ApoE具有很好的靶向效果;3、从活体成像实验中,我们可以看出治疗第12天时颅内肿瘤从大到小依次为:PBS组、Lipo-DOX组、PS-DOX组、ApoE20-PS-DOX组、TMZ组;4、ApoE-PS-DOX组治疗效果与TMZ组相当,裸鼠中位生存期从长到短依次为:TMZ组(51天)、ApoE-PS-DOX组(44天)、无靶向的PS-DOX组(35天)、Lipo-DOX组(28天)、PBS对照组(23天)。结论:新型脑胶质瘤靶向囊泡纳米载体能提升小鼠对DOX的耐受能力,且具有较长的血液循环时间;生物分布实验显示相比于PS-DOX组及Lipo组,ApoE-PS-DOX组富集到脑胶质瘤部位DOX更多;对原位脑胶质瘤有较好的治疗效果,而且能降低DOX对心脏的毒副作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：

滞留效应,实体瘤,脑胶质瘤细胞,脑胶质瘤

在穿越BBB后又能选择性靶向脑胶质瘤细胞，实现DOX药物在脑胶质瘤的高效选择性富集。图1： Enhanced Permeability and Retention 实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR效应）引自 Quantitative imaging in medicine and surgery, 2012, 2(2): 106.

受体,配体

BBB上受体和配体表达情况

纳米粒

载DOX囊泡纳米粒的大体观

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