人发角蛋白促进大鼠坐骨神经挤压伤后的神经修复

发布时间：2020-07-27 21:11

【摘要】：研究背景:周围神经损伤后轴突的再生和相应靶器官功能的恢复仍是重要的临床挑战。损伤导致轴突崩解,雪旺细胞(Schwann cells,SCs)和巨噬细胞被激活重新参与到再生修复的过程中。随着组织再生工程的不断发展,越来越多的生物材料被用以修复周围神经损伤。角蛋白是一种广泛存在于毛发、指甲和羽毛中的天然物质,具有氨基酸组成稳定、可塑性强、生物相容性好、降解性好等优点。据报道,从羊毛或羽毛中提取的角蛋白能够支持细胞的生长并促进组织的再生。本研究采用还原法提取人发角蛋白(human hair keratin,HHK),并通过进一步改变提取条件制备了人发角蛋白海绵(human hair keratin sponge,HHK sponge),分别应用于体外和体内实验。体外研究表明,HHK能促进SCs的粘附、增殖、迁移和神经营养因子的分泌,调节巨噬细胞炎性细胞因子的表达,促进背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元轴突的延伸。体内将HHK海绵包裹于坐骨神经挤压伤部位可促进损伤后神经功能的恢复。此外,HHK海绵可在5周内被机体分解和吸收,不仅为早期修复创造出一个合适的微环境,又不影响后期轴突的延伸。因此,HHK被认为是一种能够促进神经再生有前景的生物材料。研究目的:探讨HHK作为一种新型组织工程生物材料,在体外调节SCs、巨噬细胞和DRG神经元的生物学活性,在体内促进周围神经损伤后轴突的再生。研究方法:(1)HHK的提取和HHK海绵的制备。(2)通过计数分析、CCK-8实验、Transwell小室和划痕实验以及RT-q PCR来观察HHK对SCs黏附、增殖、迁移和营养因子表达的影响。(3)通过免疫荧光检测HHK调节DRG神经元轴突的延伸。(4)通过RT-q PCR检测HHK对巨噬细胞炎症因子表达的影响。(5)建立体内SD大鼠坐骨神经挤压伤模型。(6)通过坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index,SFI)、足印分析、腓肠肌湿重和肌纤维形态等指标观察HHK海绵对坐骨神经损伤后相应功能的改善情况。(7)通过透射电镜(transmission electron microscope,TEM)分析HHK海绵调节髓鞘再生的能力。研究结果:(1)经还原法提取了HHK并制备HHK海绵。(2)HHK能够促进SCs黏附、增殖、迁移和神经营养因子的表达。(3)HHK能够促进DRG神经元轴突的生长。(4)HHK能够降低巨噬细胞中促炎因子IL-6、TNF-α、i-NOS、IL-1β的表达,提高抑炎因子IL-10的表达。(5)HHK海绵在体内加快了SD大鼠坐骨神经挤压伤后神经恢复。研究结论:(1)成功的从人发提取出角蛋白并制备出HHK海绵。(2)HHK在体外能够调节多种参与神经损伤修复细胞的生物活性。(3)HHK海绵在体内加速了损伤后轴突的再生,为轴突和靶器官的连接争取了宝贵的时间。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R745;R318.08
【图文】：

分子结构图,分子结构,角蛋白

以及部分消化酶如胃蛋白酶或胰蛋白酶，如图1.1 所示[92]。需要用特定的溶剂从组织中提取角蛋白来确定其理化性质，常用的方法有还原法[93]、氧化法[94]、碱提法[95]、硫化溶解法[96]、离子液体法等[97]。不同的提取方法各有利弊，但主要目的是获得一种得率高的蛋白质。哺乳动物中角蛋白的 MW 范围在 40-70 kD，根据等电点（pI）的不同又将角蛋白分成 I 型（酸性或亚家族 A）角蛋白和 II 型（碱性或亚家族 B）角蛋白[98, 99]。天然材料能够提供细胞结合和粘附位点，与合成材料相比既适合细胞的移植也有利于细胞的迁移，更易于与周围组织相容[100, 101]，角蛋白的可塑性很强，用其制备的薄膜、水凝胶、复合支架等生物材料已被广泛生产并应用于各种生物医学领域，如骨组织工程、眼再生、伤口愈合、神经重建和皮肤替代物等，其中用人发角蛋白制备的人造血管和人造皮肤，由于其含有与真皮相同的结构与修复因子，在临床应用中效果显著且无排斥反应[102]，普通的高分子材料很难达到这一要求。人发角蛋白的分子量在 41.5-59 kDa 之间，pI 在 5.1-6.8 范围内。实验证明

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人发角蛋白促进大鼠坐骨神经挤压伤后的神经修复（8）足印分析、SFI 检测 SD 大鼠运动功能的恢复（9）腓肠肌宏观观察、腓肠肌湿重、肌纤维横截面积判断靶器官的萎缩情况（10） TEM 观察再生神经髓鞘的变化2.4 实验技术路线

技术路线图

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