RAI14通过mTOR信号调控缺氧相关星形胶质细胞炎症效应的机制研究

发布时间：2020-07-29 15:26

【摘要】：目的:视黄酸诱导14基因(Retinoic αcid-induced 14,RAI14)是由视黄酸诱导的发育调节基因,与NIK/NF-κB信号传导密切相关。在本研究中,我们检测在炎症因子和化学缺血刺激下,RAI14通过mTOR信号调控神经胶质炎症的分子机制。方法:(1)PBS(对照)、LPS(50,100和200 ng/mL)或TNF-α(5,10,20和50 ng/mL)分别刺激U87神经胶质瘤细胞6、12、24或48小时,采用RT-qPCR和免疫印迹检测LPS或TNF-α刺激不同时间RAI14 mRNA和蛋白水平变化。(2)将siR-RAI14(实验组)或siR-GAPDH(阳性对照组)采用Lipo6000TM转染试剂(空白对照)转染U87细胞,RT-qPCR测量前炎症因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。(3)免疫荧光研究敲低RAI14基因对U87细胞中NF-κKBp65活化的潜在影响。双荧光素酶测定法评价NF-κB的活性。应用Co-IP实验技术检测内源性RAI14与NF-κBp65之间的结构关联。(4)采用依维莫司(20nM)预处理之后,将U87细胞暴露于LPS(200ng/mL)6小时或TNF-α(20ng/mL)48小时,免疫印迹分析RAI14蛋白表达水平。应用RT-qPCR测定依维莫司(20nM)预处理对LPS刺激U87细胞后RAI14和炎性细胞因子的mRNA水平变化。免疫荧光分析依维莫司(20nM)处理24小时后,U87细胞中p-mTOR和p-eIF4EBP的蛋白磷酸化水平。(5)在RAI14小干扰RNA瞬时转染6小时之后,采用LPS(200ng/mL)处理U87细胞6小时。应用RT-qPCR定量评价前炎症细胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α的mRNA水平。瞬时转染小干扰RNA之后,将U87细胞暴露于LPS(200ng/mL)6小时或TNF-α(20ng/mL)48小时,经依维莫司(20nM)治疗24小时,采用免疫印迹分析p-IKK α/β(Ser176/180)和NF-κB p65蛋白的水平。(6)采用50、100、300或500 uM CoC12温育24小时后,裂解U87细胞采用免疫印迹检测RAI14蛋白表达水平。RT-QPCR实验分析CoCl2对U87细胞中IL-6和TNF-α mRNA表达的影响。(7)U87细胞暴露于TNF-α(20ng/mL)48小时后,给予青蒿素(20uM)治疗12小时,免疫印迹分析RAI14蛋白表达水平。在敲低RAI14基因后,采用TNF-α(20ng/mL)处理U87细胞48小时。RT-qPCR检测促炎细胞因子IL-1β和IL-6的mRNA水平。结果:(1)促炎激动剂能以时间和剂量依赖方式导致RAI14的mRNA水平升高。与TNF-α处理的U87细胞相比,LPS引起的效果更显著。(2)RAI14基因敲低显著下调RAI14mRNA和蛋白表达水平。与对照组相比,20ng/mL TNF-α能显著促进炎症反应。敲低RAI14基因能减弱TNF-α诱导的U87胶质炎症。(3)RAI14活性抑制能阻断NF-κBp65启动子荧光素酶活性,且siR-RAI14处理明显降低细胞核内NF-κBp65水平。虽然RAI14能与NF-κBp65在胞核和胞质部分共定位,但Co-IP未检测到内源性RAI14和NF-κBp65之间的结构关联。(4)依维莫司(mTOR抑制剂)处理显著降低RAI14蛋白的表达,但未观察到其对RAI14 mRNA水平的显著差异。依维莫司也抑制IL-1β、IL-6 mRNA和mTOR的蛋白磷酸化水平,并且增加eIF4EBP1的蛋白磷酸化水平。(5)siR-RAI14转染能诱导IL-1β,IL-6和TNF-α以低于对照组mRNA水平表达。同时,siR-RAI14转染不仅增强mTOR抑制剂对NF-κBp65负性调节作用,而且显著性促进依维莫司依赖的p-IKKα/β下调。(6)50uM CoC12能导致RAI14蛋白表达降低。给予300或500 uM CoCl2处理U87细胞反而上调了RA114蛋白表达水平。与该观察结果一致,高剂量CoCl2对IL-6和TNF-α mRNA表达的作用同时在U87细胞中表现出类似的效应。此外,也观察到依维莫司能作为NF-κBp65的有效负性调节剂,能在siR-RAI14转染实验中进一步减弱炎症效应。(7)给予青蒿素处理U87细胞能显著降低RAI14蛋白的表达,并抑制IL-6和IL-1β的mRNA表达水平。而siR-RAI14转染进一步增强这种抑制作用。结论:RAI14通过mTOR信号增强NF-κ B活化及其相关炎症效应。促炎激动剂,尤其是LPS,能上调RAI14介导的功能。在LPS和TNF-α刺激的U87细胞炎症模型当中,RAI14能正向调节前炎细胞因子的表达。RAI14还通过调控NF-κB信号传导,参与前炎细胞因子的生物学效应。另外,mTOR/eIF4EBPl信号通路参与星形胶质细胞RAI14转录翻译调节。其中mTOR活性可能是RAI14介导的NF-κ B信号途径的正向强效调节因子。上述研究为RAI 14在炎症应激和化学缺氧刺激环境下,通过mTOR信号调控NF-κ B胶质炎症效应提出了新的见解,也识别传统中药单体青蒿素对该炎症效应及信号分子的潜在药物功效。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741
【图文】：

此表明两者可能具相似功能。为了阐明上述假设，在Ｕ８７细胞中进行ｓｉＲ－ＲＡＩ１４瞬逡逑时转染实验。敲低ＲＡＩ１４基因能够显著降低ＲＡＩ１４蛋白和ｍＲＮＡ水平（分别为３８．１％和逡逑３８．７％）（图２－２，邋ａ－ｄ）。为了量化ＴＮＦ－ａ处理Ｕ８７细胞中促炎细胞因子ｍＲＮＡ表达水平，逡逑采用ＲＴ－ｑＰＣＲ测量ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ表达水平。与对照组相比，预定剂量的２０ｎｇ／逡逑ｍＬ邋ＴＮＦ－ａ显示出显著地促炎症效应（图２－２ｅ，ｆ）。尤其在ＴＮＦ－ａ处理Ｕ８７细胞４８小时后逡逑观察到ＩＬ＿１（３的最高表达水平（２６７．２％），同时ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ的水平也显著地升高（１９９．７％）。逡逑然而

此表明两者可能具相似功能。为了阐明上述假设，在Ｕ８７细胞中进行ｓｉＲ－ＲＡＩ１４瞬逡逑时转染实验。敲低ＲＡＩ１４基因能够显著降低ＲＡＩ１４蛋白和ｍＲＮＡ水平（分别为３８．１％和逡逑３８．７％）（图２－２，邋ａ－ｄ）。为了量化ＴＮＦ－ａ处理Ｕ８７细胞中促炎细胞因子ｍＲＮＡ表达水平，逡逑采用ＲＴ－ｑＰＣＲ测量ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ表达水平。与对照组相比，预定剂量的２０ｎｇ／逡逑ｍＬ邋ＴＮＦ－ａ显示出显著地促炎症效应（图２－２ｅ，ｆ）。尤其在ＴＮＦ－ａ处理Ｕ８７细胞４８小时后逡逑观察到ＩＬ＿１（３的最高表达水平（２６７．２％），同时ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ的水平也显著地升高（１９９．７％）。逡逑然而

４．２敲低ＲＡＩ１４基因减弱促炎激动剂诱导的ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ活化逡逑通过基因本体论的预测分析，ＲＡＩ１４被认为与ＮＩＫ／ＮＦ－ｋＢ信号传导相关［７］。这与实验逡逑中Ｓ１Ｒ－ＲＡＩ１４介导促炎细胞因子的表达现象是一致的（图２－２ｇ，ｈ）。为了探索ＲＡ１１４调节逡逑促炎细胞因子的精确分子机制，Ｕ８７细胞瞬时转染ｓｉＲ－ＲＡＩ１４后，采用免疫荧光分析逡逑ＮＦ－ｋＢＰ６５活化反应。与对照相比，ＴＮＦ－ｏｔ刺激的Ｕ８７细胞胞核中ＮＦ－ｋＢＰ６５荧光强度增逡逑加（图２－４ａ）。此外，与相应的ｓｉＲ－ＮＣ相比，Ｓ１Ｒ－ＲＡＩ１４瞬时转染后可降低Ｕ８７细胞胞核逡逑中ＮＦ－ｋＢＰ６５荧光强度（图２－４ｂ），此结果表明ＲＡＩ１４可促进ＮＦ－ｋＢＰ６５的核积累。值得一逡逑提的是，采用纳米颗粒转染试剂瞬时转染ｓｉＲＮＡ邋（图２－３）后，转染试剂本身对ＮＦ－ｋＢＰ６５逡逑活化和核转位显示出抑制效应。虽然发现ＲＡＩ１４与ＮＦ－ｋＢＰ６５在胞核和胞质中部分共定位逡逑（图２－４ｂ），但是Ｃｏ－ＩＰ实验并未检测到内源性ＲＡＩ１４和ＮＦ－ｋＢＰ６５之间的结构关联（图２－４ｃ）逡逑［５７］。逡逑之前的研究预测出ＲＡＩ１４可作为人类基因组中预测的转录因子和辅因子［５ｆｉ］，我们接下逡逑来在表达由启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因的Ｕ８７细胞中

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本文编号：2774146