Mas受体在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及分子机制

发布时间：2020-08-01 20:17

【摘要】：研究背景:动脉瘤性蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是一种严重危害人类健康的急危重脑血管疾病,在整个脑卒中占比7-10%左右。该疾病临床上具有极高的致死率、致残率,目前缺乏有效的治疗方案。随着手术、介入治疗手段的发展,我们对动脉瘤的控制取得了长足的进步,但对蛛网膜下腔出血所造成的继发性脑损伤仍缺乏有效的治疗措施。近年来随着人口老龄化问题的加重,脑血管病发生率正逐年攀升,每年由此造成经济损失高达数百亿,给个人、家庭和社会造成了严重的经济负担。与脑缺血相比,蛛网膜下腔出血的临床和基础研究起步较晚,由于其脑损伤病理生理机制并不明确,其临床治疗手段受到极大限制。因此,进一步阐明蛛网膜下腔出血后的病理生理机制,明确其脑损伤分子信号通路具有重要的临床与社会意义。早期脑损伤(Early BrainInjury,EBI)是指SAH后72小时内发生的一系列脑损伤,包括机械性脑损伤、缺血缺氧性损害、细胞凋亡与坏死、血脑屏障紊乱、氧化应激性损伤及脑水肿等。氧化应激是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的重要环节之一。首先,蛛网膜下腔出血早期弥漫性脑缺血缺氧会引起脑内产生大量氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS);另外,红细胞破裂将大量铁离子或含铁化合物释放入脑脊液,过剩的铁离子通过Fenton反应也可以产生大量自由基。细胞凋亡是SAH后早期脑损伤的主要病理生理机制之一,目前在蛛网膜下腔出血动物模型中证实的凋亡通路包括死亡受体通路、Caspase依赖和非依赖性通路、线粒体相关通路。氧化应激和细胞凋亡是SAH后重要的病理生理过程,进一步明确其病理生理调控机制并在关键环节做到有效干预,可能是改善SAH患者预后的一个重要途径。Mas受体是近年来发现的肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin System,RAS)新成员,在不同组织细胞中均有表达,以脑组织中尤为明显。研究表明,肾脏、外周血管内皮及肝脏组织的Mas受体具有抑制细胞凋亡和抗氧化应激作用。另外,在高血压性脑损伤模型中,Mas受体的激活同样可以减少血管内皮细胞和神经元的氧化应激性损伤及细胞凋亡。尽管如此,Mas受体在蛛网下腔出血后早期脑损伤中的作用及具体机制并不明确。UCP-2是线粒体内膜上一种离子通道蛋白,在调节线粒体稳态与能量代谢方面具有重要意义。研究表明UCP-2在肺、胃、肝及巨噬细胞中均有调节线粒体ROS产生和细胞凋亡的功能。在脑缺血体外模型中,UCP-2高表达的细胞更能耐受氧糖剥夺(Oxygen-glucose Deprivation,OGD)干预。进一步在大脑中动脉闭塞模型中研究发现,UCP-2转基因小鼠的线粒体ROS水平明显低于非转基因组,其脑梗死面积也明显低于对照组,提示UCP-2参与神经元缺血缺氧后的脑保护作用。UCP-2对氧化应激及细胞凋亡的抑制作用已经明确,但其上游的具体调控机制并不清楚。目前的研究表明UCP-2表达水平与转录因子CREB的活性有关,而PKA/CREB已被证实为Mas受体的下游通路,因此我们推测PKA/CREB/UCP-2可能是介导Mas受体抗氧化应激与细胞凋亡作用的通路。Mas受体作为脑内RAS的一新分支,对脑内病理生理的调控作用广泛,是急性脑血管病治疗的一个潜在靶点。本研究采用经鼻腔给予Mas受体激动剂AVE 0991(AVE),明确其能否改善SAH后神经功能障碍以及该药物对SAH后氧化应激及神经元凋亡的影响,并进一步探索其作用的分子机制。第一部分Mas受体在蛛网膜下腔出血后氧化应激及神经元凋亡中的作用研究目的:本部分实验观察Mas受体在神经元上的表达情况,了解大鼠脑内Mas受体在蛛网膜下腔出血后的表达变化情况,进一步阐明Mas受体的激动剂AVE对大鼠蛛网膜下腔出血后的神经功能、氧化应激及神经元凋亡的影响,为选择性调控脑内Mas轴治疗SAH后早期脑损伤提供理论依据。研究方法:(1)采用左侧颈内动脉穿刺法建立大鼠SAH模型,采用免疫荧光染色观察Mas受体在神经元上的表达情况,进一步用Western blot方法检测Mas受体在SAH后不同时间点(3h、6h、12h、24h及72h)的表达变化情况。(2)实验分组包括:Sham,SAH+vehicle(10%DMSO),SAH+AVE(0.3mg/kg),SAH+AVE(0.9mg/kg)及 SAH+AVE(2.7mg/kg)。SAH 诱导后 lh 经鼻腔给予 AVE 治疗,24h后评估大鼠神经功能(包括改良Garcia评分及平衡木行走试验评分)、TUNEL检测神经元凋亡、DHE检测氧自由基水平、Western blot检测相应的下游蛋白分子水平,包括 PKA、p-CREB、CREB、UCP-2、Bcl-2、Bax、Romo-1。(3)实验分组包括:Sham,SAH+vehicle(10%DMSO)及 SAH+AVE(0.9mg/kg)。SAH诱导后1h经鼻腔给予AVE治疗,SAH后第7、14、21天分别行Rotarod测试,评估肢体协调功能;第22-27天行水迷宫测试,评估空间记忆及学习能力,采用Floro-JadeC染色评估海马区(CA1,CA2及DG)神经元变性情况。(4)实验分组包括:naive+vehicle(10%DMSO)和 naive+AVE(0.9mg/kg)组。经鼻腔给药6小时后取脑行高效液相色谱/串联质谱(Liquid Chromatography-mass Spectrometry/Mass Spectrometry,LC-MS/MS)分析,明确 AVE能否经鼻腔进入脑内。研究结果:(1)Mas受体表达水平在SAH后受到抑制,以SAH后24h最明显,随后在72h时逐步恢复;Mas受体与神经元标记物(NeuN)共定位,提示Mas受体在神经元上表达。(2)3 组不同剂量 AVE(0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg)均能改善改良 Garcia神经功能评分,但只有中剂量组可以同时改善Garcia及平衡木行走试验评分;AVE能显著减轻SAH后大脑皮层的氧化应激水平,同时抑制神经元凋亡的发生。(3)AVE能显著改善大鼠SAH后1周时的肢体协调功能,但在SAH后2、3周时治疗组和对照组无显著差别;AVE能显著改善大鼠SAH后的学习能力及空间记忆能力。(4)LC-MS/MS提示经鼻腔给予AVE后能在脑内检测到AVE,提示该药物能经鼻腔给进入脑内。研究结论:脑内RAS的Mas轴在SAH后受到抑制,是引起EBI中氧化应激及神经元凋亡的病理生理机制之一;针对Mas轴的选择性调控是SAH治疗的一个潜在靶点。第二部分Mas受体抑制蛛网膜下腔出血后氧化应激及神经元凋亡的机制研究研究目的:本部分进一步阐明Mas受体在SAH后氧化应激及神经元凋亡中的作用,探索Mas/PKA/CREB/UCP-2信号通路在介导AVE抗氧化应激及抗神经元凋亡中的作用,进一步证实该受体在SAH后早期脑损伤中的作用,为探索SAH后早期脑损伤的治疗开拓新的研究思路。研究方法:(1)实验分组包括:SAH+AVE+normal saline(NS),SAH+AVE+A779,SAH+AVE+scrambled siRNA(scr siRNA)及 SAH+AVE+UCP-2 siRNA。SAH 诱导前1小时经侧脑室给予A779或等体积的生理盐水,建模前48小时经侧脑室给予scr siRNA或UCP-2 siRNA。SAH诱导后1h经鼻腔给予AVE治疗,24h后评估SAH后神经功能(包括改良Garcia评分及平衡木行走试验)、Western blot检测相应的下游分子水平,包括 PKA、p-CREB、CREB、UCP-2、Bcl-2、Bax、Romo-1。(2)实验分组包括:naive+scr siRNA,naive+UCP-2 siRNA,SAH+scr siRNA,SAH+UCP-2 siRNA。建模前 48 小时经侧脑室给予 scr siRNA 或 UCP-2 siRNA。SAH诱导后24h评估神经功能(包括改良Garcia评分及平衡木行走试验)、Western blot检测UCP-2蛋白表达水平,进一步明确UCP-2的敲除效率。研究结果:(1)Mas受体抑制剂A779能阻断AVE的神经保护作用,并逆转AVE诱导的PKA、p-CREB、UCP-2、Bcl-2、Bax、Romo-1 表达。(2)经侧脑室给予UCP-2 siRNA能显著抑制UCP-2的表达水平,UCP-2敲除能阻断AVE的神经保护作用,逆转AVE诱导的Bcl-2、Bax、Romo-1表达,但对PKA及p-CREB的表达无明显影响。研究结论:Mas/PKA/CREB/UCP-2是介导AVE对大鼠SAH后早期脑损伤保护作用的重要信号通路之一,该部分研究阐明了 UCP-2在SAH后早期脑损伤中的作用,为后续针对Mas/UCP-2通路治疗SAH后早期脑损伤提供理论依据。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.35
【图文】：

脑损伤,病理生理,脑血管痉挛,迟发性

浙江大学博士学位论文逦逡逑上，近２１％的蛛网膜下腔出血患者在没有脑血管痉挛的情况下出现了迟发性缺血逡逑性神经功能障碍，而发生脑血管痉挛的患者中只有２０－３０％会出现迟发性缺血性神逡逑经功能障碍［６］。Ｊｏｈｎ邋Ｈ．邋Ｚｈａｎｇ等的研究表明早期脑损伤是影响蛛网膜下腔出血患逡逑者长期预后的主要因素，针对早期脑损伤的治疗是改善ＳＡＨ患者预后的潜在靶点逡逑［２＿５］。目前对ＳＡＨ的研究重点已从传统的脑血管痉挛研究转向早期脑损伤机制的逡逑研究，而针对早期脑损伤发生的病理生理机制早期治疗是改善ＳＡＨ后神经功能障逡逑碍的一个重要途径。逡逑ｙ逦逦逡逑

示意图,血管紧张素,肾素,示意图

前言逡逑早期脑损伤机制十分复杂，涉及氧化应激、细胞凋亡、细胞坏死、脑水肿、神逡逑经炎症、血脑屏障紊乱等多个方面（图１．１）［２］。蛛网膜下腔出血后大量血液进入逡逑蛛网膜下腔，颅内压迅速升高而灌注压显著下降，脑组织处于严重的缺血缺氧状逡逑态，这是ＳＡＨ后早期脑损伤的主要始动因素［４］。ＳＡＨ后氧化应激性损伤在以往的逡逑研究中已经得到证实［７］。出血后早期，局部血流减少对脑组织的损害远不及对脑代逡逑谢的抑制，而后者会使脑处于氧化应激状态。另外，红细胞的溶解将大量铁离子逡逑或含铁化合物释放入脑脊液，过剩的铁离子通过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生大量自由基，后逡逑者可以导致ＤＮＡ、脂质过氧化及蛋白质氧化，进而引起生物膜损伤、炎症反应、逡逑细胞凋亡等其他病理生理改变［７］。细胞凋亡是ＳＡＨ后早期脑损伤的主要病理生理逡逑机制之一，这种继发于全脑缺血性损伤会引起广泛性细胞凋亡，这种现象在动物逡逑模型和尸检中均已得到证实［８］。ＳＡＨ后引起全脑缺血

实验设计,动物

为常见的并发症，可能与出血之后海马区域神经元损伤有关，提示Ｍａｓ可能作为逡逑ＳＡＨ的治疗靶点。逡逑图２．１．１邋ＡＶＥ的化学分子结构式．逡逑Ｆｉｇ．邋２．１．１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＶＥ．逡逑ＡＶＥ是近年来新发现的选择性Ｍａｓ受体激动剂，可以完全模拟内源性Ａｎｇ－（ｌ－７）逡逑对Ｍａｓ的激动作用［１８］。与Ａｎｇ－（ｌ－７）相比，ＡＶＥ具有化学性质更稳定、结合特异性逡逑更高、作用更强等特点。研究发现ＡＶＥ在脑缺血模型、血管内皮细胞、风湿逡逑性关节炎等方面具有抗氧化应激、抗凋亡及抗炎作用［１８，２３－２５１，但ＡＶＥ在蛛网下腔逡逑出血后早期脑损伤中的作用及具体机制并不明确。逡逑因此，在本研究中，我们提出以下假说：ＡＶＥ通过选择性激活脑ＲＡＳ的Ｍａｓ逡逑轴起到抑制ＳＡＨ后氧化应激性损伤及神经元凋亡的作用。逡逑１１逡逑

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