靶向敲除长链非编码RNA ANRIL对人胶质瘤细胞生长抑制及其机制的研究

发布时间：2020-08-02 15:39

【摘要】：背景:胶质瘤(glioma)是成人神经系统中最常见的恶性肿瘤。胶质瘤按肿瘤的细胞形态分为星型细胞瘤、少枝突细胞瘤、室管膜瘤以及混合细胞瘤;按恶性程度分为I-IV级。胶质瘤侵袭性强并且生长又极其迅速,且对化疗药物具有耐药性,所以目前虽然临床上手术后应用放化疗等治疗,但效果仍不明显。现在从分子角度对胶质瘤进行诊断和治疗已经越来越迫切。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是由超过200个核苷酸组成,由DNA转录非编码蛋白质。虽然人类基因组中存在着成千上万的此类分子,只有很少一部分得以确定其生物作用。lncRNAs具有广泛的生物学作用,包括影响细胞凋亡、侵袭,组蛋白的修饰等。ANRIL是一段位于INK4位点的反义非编码RNA,其长度为3.8kb,是从位于9p21上反向转录INK4B-ARF-INK4A基因丛而来,主要定位于细胞核。该位置的突变与人类一些癌症相关,如神经胶质瘤、白血病、黑色素细胞瘤、基底细胞癌、鼻咽癌和乳腺癌等。miRNA是一类长约19-24个核糖核苷酸的非编码小RNA分子,其与肿瘤的生长、侵袭、新血管生成和凋亡等密切相关。mi R-34a为其中之一,具有抑癌基因的作用。miR-34a可与靶基因Sirt1的3′UTR上的保守位点特异性结合抑制基因的表达。Sirt1是哺乳动物去乙酰化酶家族中的一员,具有细胞生存及转录沉默等作用。目的:目前ANRIL的潜在临床意义还不明确,并且其与胶质瘤的相关研究并不多。所以本实验目的为:探究ANRIL、miR-34a及Sirt1在胶质瘤中的作用以及潜在关联,以及对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡等的影响机制。方法:在本实验中,我们使用胶质瘤细胞系,胶质瘤组织,正常脑组织以及胶质瘤种植裸鼠作为实验对象,主要应用的实验方法有:CCK-8法,细胞克隆实验,流式细胞术,Transwell小室侵袭实验及westernblot,siRNA基因沉默,Real time-RT-PCR,细胞转染及报告载体的构建与荧光素酶报告基因检测等技术。首先我们测定了在患者胶质瘤细胞以及五种细胞系中ANRIL的表达。然后评估了抑制ANRIL后对miR-34a表达的影响,以及对胶质瘤细胞U251的增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响。最后探讨了相关的信号通路机制。本论文的主要实验结果如下:(1)ANRIL在胶质瘤组织及胶质瘤细胞中是上调的,对其进行敲除后可以抑制胶质瘤的增殖、迁移、侵袭,并且促进凋亡。敲除ANRIL体内实验中显著减小了裸鼠种植肿瘤的体积。(2)ANRIL对miR-34a具有分子海绵作用,抑制ANRIL后miR-34a明显上调,ANRIL抑制后对胶质瘤细胞的其中一个作用机制是通过上调miR-34a进行的。(3)Sirt1是miR-34a的靶基因之一。miR-34a过表达可通过下调Sirt1,抑制细胞活性、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。(4)Sirt1是通过PI3K/AKT/mTOR通路发挥作用。miR-34a过表达介导的下调Sirt1表达从而抑制了PI3K/AKT和m TOR通路,抑制了胶质瘤的活性、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。结论:综上所述,ANRIL在胶质瘤中上调,我们的研究证实ANRIL抑制后抑制了胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭的其中一个机制是上调miR-34a介导的。而且,miR-34a过表达介导的下调Sirt1表达,随后抑制PI3K/AKT和mTOR双通路产生。因此本实验研究揭示抑制ANRIL并且上调miR-34a可作为治疗胶质瘤的策略。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

磷脂酶D,诊断指标,肿瘤细胞凋亡,原癌基因

图 1.1 lncRNA 对 miRNA 的作用[45]1.2.4 长链非编码 RNA ANRIL 与肿瘤1.2.4.1 ANRIL 与肺癌研究发现，在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中ANRIL表达上调，并且在预后不良的患者肺癌组织中表达增高更加明显，ANRIL可以作为预后判断的独立诊断指标。敲除ANRIL后在体内及体外实验中NSCLC细胞增殖受到抑制，且促进肿瘤细胞凋亡[46]。本文也是通过阅读此文献时收到启发，对ANRIL与胶质瘤之间关系进行检索。此项研究发现ANRIL的过表达不能抑制p15在PC9细胞的表达，可以抑制P21及KLF2的转录。有报道ANRIL具有NSCLC原癌基因的作用[47]。另一项研究发现在肺癌细胞中抑制磷脂酶D（PLD）后ANRIL表达明显上调[48]。抑制PLD可以诱导肺癌细胞凋亡，抑制ANRIL

胶质细胞,表达水平,基因表达,样本

吉林大学博士学位论文因 Ct 值-内参基因 Ct 值，△△Ct=待测基因△Ct-照组样本△Ct，然后数行分析，此数值表示待测样本基因表达量相对于对照样本基因表达量实验中我们将胶质瘤细胞与正常胶质细胞相比，得到如下结果。实验结量 RT-PCR 结果显示 ANRIL 在胶质瘤细胞中明显比正常胶质细胞表达87、U251、SHG-44 胶质瘤细胞系中 ANRIL 表达较 BT325、A172 细胞

胶质瘤,表达水平,Ⅳ级,差别

结果表明胶质瘤组织中 ANRIL 表达较瘤旁组织（PT）表达明显升高。（图2.2）（P<0.01）。胶质瘤Ⅰ级和Ⅱ级 ANRIL 表达差别不大，Ⅲ级和Ⅳ级 ANRIL 表达差别不大，但是Ⅲ/Ⅳ级明显比Ⅰ/Ⅱ级 ANRIL 表达升高（图 2.2）（P<0.01），Ⅲ

【参考文献】