乙酰乙酸、β-羟丁酸对糖氧剥夺诱导胎鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-08-16 21:20

【摘要】：我们的研究小组在前期实验中,经大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型侧脑室给β-羟丁酸,发现适当剂量的酮体主要成分之一β-羟丁酸可显著减少MCAO模型鼠脑组织梗死灶范围和改善神经功能障碍,对MCAO模型发挥脑保护作用。为进一步明确酮体在缺血缺氧环境下的脑保护作用及其机制,本研究设计旨在探讨酮体主要成分乙酰乙酸和β-羟丁酸对体外原代培养的SD胎鼠大脑皮质神经元细胞氧化性损伤是否有保护作用及其可能的相关机制。以无血清无糖培养基和三气培养箱(healforce)进行缺氧培养的方式建立胎鼠大脑皮质神经元细胞氧化性损伤的体外模型,并在此基础上从细胞层面上研究不同浓度乙酰乙酸和β-羟丁酸经历不同预处理时间对糖氧剥夺致原代培养大鼠脑皮质神经元细胞损伤的拮抗作用以及其量效、时效关系。本课题主要分为以下两部分:第一部分乙酰乙酸、β-羟丁酸对胎鼠大脑皮质神经元活力的影响[目的]取SD胎鼠(孕期15-20d)大脑皮质组织进行原代神经元的分离、纯化与培养,鉴别神经元的纯度,观察乙酰乙酸、β-羟丁酸对原代培养SD胎鼠大脑皮质神经元细胞存活率的影响及其量效、时效关系。[方法]1、购买孕期15-20d SD孕鼠,取胎鼠大脑皮质组织进行原代神经元细胞培养。2、培养7天后海马神经元细胞进行神经元细胞纯度鉴别。3、原代培养7天的新生鼠海马神经元细胞分成正常对照组(正常neuron cell组)和实验组。实验组分成Ⅰ组(乙酰乙酸组)、Ⅱ组(β-羟丁酸组),各大组中均含有 10 个浓度的小组(1mM,2mM,3mM,5mM,10mM,20mM,30mM,40mM,50mM,1OOmM),每个浓度小组设给药后作用12h、24h、36h三个时间点,每组设5个平行样。4、CCK8法测定细胞增殖和细胞毒性,间接反映细胞存活率。[结果]1.原代SD胎鼠大脑皮质神经元细胞培养第7天观察神经元细胞生长良好,胞体较大,胞突主干和分枝明显延长并增粗,其突起形成稠密的神经网络。2.免疫细胞化学法NSE鉴定神经元的经典方法。由结果可见分散的皮质神经元,神经元是主体,可占95%以上。3.CCK8比色分析法检测神经元的存活率,结果显示:随乙酰乙酸浓度在1～10mM范围内递增,其神经元细胞的存活率与正常对照组并无统计差异(P0.05);在20～100mM范围内时,其神经元细胞的存活率较正常对照组显著降低(P0.01),且在30～1OOmM范围内递增时,其神经元细胞的存活率呈现递减趋势(P0.05),同一浓度作用时间延长其神经元细胞的存活率无统计学差异(P0.05)。随β-羟丁酸浓度在1～5mM范围内递增、作用时间在12～36h内递增,其神经元细胞的存活率与正常对照组并无统计差异(P0.05);在10mM浓度作用12h～24h时,其神经元细胞的存活率较正常亦无统计差异(P0.05),但在作用延长至36h时,其神经元细胞的存活率较正常对照组显著降低(P0.05);浓度在20～100mM范围内时,其神经元细胞的存活率较正常对照组显著降低(P0.01),且随着浓度递增其神经元细胞的存活率呈现递减趋势(P0.05),浓度在20～50mM范围内时,同一浓度随作用时间延长其神经元细胞的存活率呈现进行性降低趋势(P0.05),在1OOmM浓度时,各时间点之间神经元细胞的存活率无统计差异(P0.05)。[结论]实验结果发现,乙酰乙酸浓度≤1OmM对神经元细胞无细胞毒性,说明这个浓度区间的乙酰乙酸可以作为后续实验安全剂量。β-羟丁酸浓度≤5mM对神经元细胞无细胞毒性;β-羟丁酸浓度为10mM且作用时间≤24h时,其对神经元细胞无细胞毒性,但当作用时间延长至36h时,其对神经元细胞有细胞毒性,说明≤1OmM浓度区间的β-羟丁酸可以作为后续实验安全剂量,且作用时间以≤24h为宜。第二部分乙酰乙酸、β-羟丁酸对糖氧剥夺诱导胎鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及其分子机制研究[目的]观察乙酰乙酸、β-羟丁酸对糖氧剥夺后胎鼠大脑皮质神经元细胞凋亡的影响及其机制研究。[方法]1、原代培养7天的SD胎鼠大脑皮质神经元细胞,分成两大组,即正常培养组与糖氧剥夺培养组(糖氧剥夺系无血清无糖培养基接种细胞后,以三气培养箱(healforce)进行缺氧培养。),每个大组分7个小组即对照组、高剂量乙酰乙酸组、中剂量乙酰乙酸组、低剂量乙酰乙酸组、高剂量β-羟丁酸组、中剂量β-羟丁酸组和低剂量β-羟丁酸组,共计14个组。在这14个组的基础上,设1h、5h、24h三个时间点。其中乙酰乙酸组低、中、高剂量3个浓度分别为2mM组、5mM组及8mM组,β-羟丁酸组低、中、高剂量3个浓度分别为2mM组、5mM组及10mM组。分别在作用1h、5h和24h后取细胞进行检测。2、采用CCK8法测定细胞增殖,间接反映细胞存活率。3、采用线粒体呼吸链复合物Ⅲ(辅酶Q-细胞色素C还原酶)检测作线粒体分析。4、采用NSE荧光染色观察神经元细胞形态及计算细胞纯度。5、采用Tunel染色观察细胞凋亡情况。6、采用 Western Blot 法检测凋亡蛋白 caspase3、bcl2、bax 与 Cytochrome C 蛋白(CytC)。[结果]1、CCK8检测法测定细胞存活率正常培养大组仅大剂量乙酰乙酸组在24h时间点神经元细胞的存活率增高(P0.05),其余各组各剂量、各时间点神经元细胞的存活率均无统计差异(P0.05)。糖原剥夺组各时间点神经元细胞的存活率较正常培养组显著降低(P0.05);在24h时间点,乙酸乙酸组与β-羟丁酸组中的中剂量组和高剂量组神经元细胞的存活率较糖原剥夺组显著增加,有统计差异(P0.01),高剂量组增加更显著(P0.01),但仍低于正常培养组(P0.05),而低剂量组神经元细胞存活率较糖原剥夺组无显著差异(P0.05);在1h和5h时间点时,各组神经元细胞的存活率均无显著差异(P0.05)。2、线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性(辅酶Q-细胞色素C还原酶)检测线粒体分析结果显示:正常培养大组中乙酰乙酸与β-羟丁酸低、中、高剂量组神经细胞线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性均无明显差异(P0.05)。糖氧剥夺大组中各剂量组神经细胞线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性均较正常培养组(即Normal)明显降低(P0.01),乙酰乙酸与β-羟丁酸中、高剂量组较糖氧剥夺组(即Control)显著升高(P0.05),且中剂量组较高剂量组升高更明显(P0.05),而低剂量组较糖氧剥夺组无明显差异(P0.05)。3、NSE荧光染色观察神经元细胞形态正常培养大组各组神经元细胞胞体呈圆形或三角形,胞膜和核膜完整,胞体和胞核着色均匀一致,轴突和突起伸展,细胞与细胞间形成稠密的细胞连接网。在糖氧剥夺培养组中可见神经元细胞胞体有所变小,变形,细胞膜和核膜完整,但胞体出现发泡现象,随着发泡现象明显,其神经突起出现缩短甚至消失,细胞出现变圆。乙酰乙酸组与β-羟丁酸组中的中剂量组和高剂量组中均可见神经元细胞胞体变形现象、胞体发泡现象有所减少,突起缩短、消退现象有所改善,且高剂量组尤为明显,胞体发泡现象明显减少,胞膜、核膜界限清晰,细胞突起伸展良好,可见细胞与细胞间的连接网。而低剂量组与糖氧剥夺培养组之间的细胞形态无明显差异。4、Tunel染色观察细胞凋亡情况对各组神经元细胞TUNEL指数进行了分析显示:糖原剥夺大组中各小组神经元细胞TUNEL指数显著增高(P0.05);乙酰乙酸组与β-羟丁酸组中的中剂量组和高剂量组神经元细胞TUNEL指数较糖原剥夺组显著降低(P0.01),高剂量组降低更显著(P0.01),但仍明显高于正常培养组(P0.05),而乙酰乙酸组与β-羟丁酸组中的低剂量组神经元细胞TUNEL指数较糖原剥夺组无显著差异(P0.05)。5、Western Blot 法检测凋亡蛋白 caspase3、bcl2、bax 与 CytC 蛋白 Western Blot实验结果可见,与正常培养组相比,糖氧剥夺组caspase3、bcl2、bax与CytC蛋白均呈高表达状态(P0.01)。糖氧剥夺后,乙酰乙酸与β-羟丁酸中、高剂量组caspase3、bax与CytC蛋白表达均较糖氧剥夺组明显减少(P0.05),且高剂量组减少更显著(P0.05),但仍高于正常培养组(P0.05),而乙酰乙酸与β-羟丁酸中、高剂量组bcl2蛋白表达较糖氧剥夺组明显增加(P0.05),且高剂量组增加更显著(P0.05)。乙酰乙酸与β-羟丁酸低剂量组caspase3、bax、bc12与CytC蛋白表达均较糖氧剥夺组无明显差异(P0.05)。[结论]在糖氧剥夺后,适当剂量的乙酰乙酸和β-羟丁酸可以减轻糖氧剥夺致体外培养的胎鼠大脑皮质神经元细胞的毒性作用,通过促进抗凋亡因子bcl-2蛋白表达、抑制促凋亡因子bax蛋白表达和增强线粒体呼吸功能等进而降低caspase3蛋白的表达,最终实现改善糖氧剥夺所致的神经元细胞的凋亡,促进神经元存活,发挥神经元细胞保护作用。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743
【图文】：

１、况观皮质神经元细胞接种２ｈ后，倒置显微镜下观察细胞生长情况，可见细胞贴壁逡逑生长，但大多数贴壁不牢固，大部分神经元呈小圆形，少数神经元细胞的胞体呈条逡逑索状，细胞的两端开始有短的突起出现。培养Ｉｄ后，神经细胞的突起开始逐渐延逡逑长，部分细胞出现聚集融合的现象。培养２ｄ后，神经元突起开始逐渐增多延长，逡逑并开始形成稀疏的神经网络（见图卜Ａ）。培养４￣５山神经元细胞胞体开始逐渐生逡逑长，突起延长并形成较致密的神经网络（见图１－Ｂ）。培养７ｄ，典型样生长，胞体逡逑透亮变大，胞体两侧长轴突伸出，并形成了稠密的神经网络结构（见图卜Ｃ）。逡逑２、神经元细胞纯度鉴定结果逡逑对分离培养纯化的细胞行ＮＳＥ荧光染色，可见ＮＳＥ染色阳性的细胞（见图１－Ｄ），逡逑ＤＡＰＩ显示出所有细胞核的标记物（见图１－Ｅ），两图重叠（ｍｅｒｇｅ）之后（见图１－Ｆ），逡逑计算神经元所占的比例，其神经元细胞纯度＞９５邋％。逡逑

低（Ｐ＜０．０１），且在３０？ｌＯＯｍＭ蒗围内递增时，其神经元细胞的存活率呈现递减趋逡逑势（Ｐ＜０．０５），同一浓度作用时间延长其神经元细胞存活率无统计学差异（Ｐ＞0．0５）逡逑（见图２－Ａ）。当ｐ－羟丁酸浓度的在１？５ｍＭ范围内递增、作用T间在１２？３６ｈ内递逡逑增，其神经元细胞的存活率与正常对照组并无统计差异（Ｐ＞0．0５）；在１０ｍＭ浓度逡逑作用１２ｈ？２４ｈ时，其神经元细胞的存活率较正常亦无统计差异（Ｐ＞０．０５），但在作逡逑用延长至３６ｈ时，其yL经元细胞的存活率较正常对照组显著降低（Ｐ＜０．０５）；浓度逡逑在２０？ｌＯＯｍＭ范围内时，其神经元细胞的存活率较正常对照组显著降低（Ｐ＜０．０１邋），逡逑且随着浓度递增其神经元细胞的存活率呈现递减趋势（Ｐ＜0．0５），浓度在２０？５０ｍＭ逡逑范围内时，同一浓度随作用T间延长其神经元细胞的存活率呈现进行性降低趋势逡逑（Ｐ＜０．０５），在ｌＯＯｍＭ浓度时，各时间点之间神经元细胞的存活率无统计差异逡逑（Ｐ＞０．０５）（见图邋２－Ｂ）。逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑Ｖ．邋＿逦Ｉ逦Ｉ逦■逦■邋ＡＣ邋５ｍ、ｌ逡逑Ｉ邋Ｓ邋６0＂逦Ｉ邋ｒ１！逦Ｉ邋ｎ．逦■邋ｈ逦ＡＣ邋１０ｍ、ｌ逡逑＂ｊ逦ＩＩＩ邋ｉｉ？逦ｌｌｌｌｉｉ邋ｉｌｉ＝ｌＥ逡逑＾逦＾Ｓ°逦ｍｍ邋ＡＣ邋ｌＯＯｍＭ逡逑ｌ＇ｉｍｅ（邋ｈｏｕｒｓ）逡逑？邋？邋？气ｎ邋ｉｉＡ．邋＿ａ逦１邋１．邋．邋．逦■邋｜逦．．邋／＊／邋＊＊邋＇＊邋－邋Ｉ逦、0邋ｒ邋ｍ邋ａ邋Ｉ逡逑一…■邋Ｉ邋１逦二：一■？邋｜邋］逦’邋■邋Ｉ邋｜逦ＢＨＢ

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本文编号：2794962