应用导入HSVtk基因的骨髓间充质干细胞治疗胶质瘤的实验研究
发布时间：2020-08-19 11:09
【摘要】：目的:恶性胶质瘤是人脑最常见的恶性肿瘤,但目前无论手术治疗还是放化疗,治疗效果都不是很理想,因此基因治疗方案越来越受学者们关注。单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSVtk/GCV,herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir)肿瘤自杀基因治疗系统具有显著的杀伤肿瘤作用,但由于单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因在体转导效率很低,而利用体外导入HSVtk基因又一直没有找到合适的载体细胞,因此直接阻碍了该治疗方案在临床上的进一步应用。近年来,有研究表明骨髓间充质干细胞具有在基因治疗中携带和运送治疗基因的能力,而且已经发现了携带了HSVtk基因的骨髓间充质干细胞(BMSC-tk)与不同种系的胶质瘤细胞之间存在着较好的旁观者效应。本研究旨在进一步探讨TK骨髓间充质干细胞(BMSC-tk)的体外抗肿瘤作用。方法:C6(大鼠胶质瘤细胞)的培养。原代BMSC(大鼠骨髓间充质干细胞)的提取,形态学鉴定及培养。Transwell小室迁移实验来验证BMSC向C6的定向迁移能力。pEX-4-herpesvirus进行外源性HSVtk基因对C6和BMSC细胞转染,并观察两种细胞的转染效率。细胞增殖测试实验(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测C6-tk(TK大鼠胶质瘤细胞)及BMSC-tk细胞对GCV的体外敏感性。C6与BMSC-tk共培养在不同浓度(0~100ug/ml)GCV(更昔洛韦)的条件培养液,用CCK-8分析法检测存活的细胞数量来评价其抗肿瘤活性。结果:培养过C6细胞的条件培养基组的穿膜细胞数显著高于Control(新鲜培养基)组(P0.001)。C6的转染效率超过20%,而BMSC的转染效率还不到10%,且荧光强度较弱。C6-tk及BMSC-tk的细胞存活率随GCV浓度增大均出现明显的下降趋势;与Control组相比,GCV浓度大于0.1ug/ml时C6-tk的细胞存活率开始下降,而BMSC-tk细胞是当GCV浓度大于0.3ug/ml时开始下降;当GCV浓度增至10ug/ml时C6-tk和BMSC-tk细胞的存活率下降均最为显著(P0.001),而继续增大GCV浓度,细胞存活率都再无显著下降(P0.05)。GCV浓度为1、3、10、30、100ug/ml时BMSC-tk+C6的细胞存活率均有显著下降(P0.05、P0.01、P0.001、P0.001、P0.001)。其中10ug/ml组BMSC-tk+C6的细胞存活率下降最为显著,而继续提高GCV的浓度后BMSC-tk+C6的细胞存活率较10ug/ml组不再明显下降。在GCV浓度为10ug/ml时BMSC-tk细胞与BMSC-NC细胞相比下降的OD值显著低于BMSC-tk+C6细胞与BMSC-NC+C6细胞相比下降的OD值(P0.001)。结论:1.BMSC对胶质瘤细胞具有明显的定向迁移能力。2.C6-tk细胞在体外条件下对GCV有显著的敏感性,且敏感性最为显著时的最低GCV浓度为10ug/ml;3.BMSC-tk细胞在体外条件下对GCV有显著的敏感性,且敏感性最为显著时的最低GCV浓度为10ug/ml;4.BMSC-tk在体外条件下对C6细胞存在明显的杀伤作用,且杀伤作用达到最大时的最低GCV浓度为10ug/ml;
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：
中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 原代大鼠骨髓间充质干细胞的提取刚接种的 BMSC 体积很小，呈圆形（图 1A ）。 第 3 天胞贴壁，体积仍较小，形态多样，大部分细胞形态呈椭圆形、伸出长短不一、粗细不等的胞质突起互相连接（图 1B ）。 7 天形成大小不一的细胞集落，细胞数量明显增多，体积增大，以状向四周扩展（图 1C ）。 传代后细胞生长旺盛，呈长梭形、形态均一，趋向一致（图 1D）。
图 2 BMSC 对 C6 细胞定向迁移能力的测定，Control 代表新鲜培养基组，conditioned medium代表培养过 C6 细胞的条件培养基组。A：小室下为不同培养基时 BMSC 通过 transwell 小室人工基膜的基底层后染色，在显微镜下的图片，a 代表小室下为新鲜培养基时 BMSC 迁移后染色，显微镜下的图片；b 代表小室下为培养过 C6 细胞的培养基时，BMSC 迁移后染色，显微镜下的图片。B：BMSC 在不同培养基下迁移通过基膜的细胞数的统计图，结果以均数±标准差表示（n=5），conditioned medium 组与 Control 组相比存在显著差异以*** P <0.001 表示。3.3 C6 和 BMSC 导入 HSV-tk 的转染效率C6 细胞和 BMSC 细胞均导入空载质粒（ex-NC）和 TK 质粒（ex-TK），转染后48 小时分别在显微镜的同一视野计数各自在荧光下带有荧光标记的细胞数和在正常光源下的细胞数，根据两者的比值计算出各自的转染效率，每种细胞随机选取 5个视野计数。如图 3A 所示：C6 细胞转染后在荧光下观察带光的细胞数比 BMSC
图 3 C6 细胞和 BMSC 细胞的转染效率。A：C6 细胞和 BMSC 细胞转染 ex-NC（空载质粒）和ex-TK（TK 质粒）后在荧光下的图片，a 代表 C6 转染 ex-NC 的图片；b 代表 C6 转染 ex-TK 的图片；c 代表 BMSC 转染 ex-NC 的图片；d 代表 BMSC 转染 ex-TK 的图片。 B：两种细胞转染效率的统计图，结果以均数±标准差表示（n=5），BMSC ex-NC 组与 C6 ex-NC 组相比存在显著差异以***P<0.001 表示；BMSC ex-TK组与 C6 ex-TK 组相比存在显著差异以***P<0.001 表示。3.4 C6-tk 细胞对 GCV 的体外敏感性CCK-8 分析法测定细胞存活率。如图 4A 所示，Control 组及 ex-NC 组随 GCV浓度的增大细胞存活率无明显下降，而 ex-TK 组的细胞存活率随 GCV 浓度增大出现明显的下降趋势。与 Control 组相比，GCV 浓度大于 0.1ug/ml 时 ex-TK 组的细胞存活率开始下降，当 GCV 浓度增至 10ug/ml 时细胞的存活率下降最为显著（P<0.001），而继续增大 GCV 浓度，细胞存活率再无显著下降（P>0.05）。如图 4B，C，D 所示：GCV 浓度为 0.3、1、10μg/ml 时，ex-TK 组的细胞存活率与 Control
本文编号：2797020
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：
中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 原代大鼠骨髓间充质干细胞的提取刚接种的 BMSC 体积很小，呈圆形（图 1A ）。 第 3 天胞贴壁，体积仍较小，形态多样，大部分细胞形态呈椭圆形、伸出长短不一、粗细不等的胞质突起互相连接（图 1B ）。 7 天形成大小不一的细胞集落，细胞数量明显增多，体积增大，以状向四周扩展（图 1C ）。 传代后细胞生长旺盛，呈长梭形、形态均一，趋向一致（图 1D）。
图 2 BMSC 对 C6 细胞定向迁移能力的测定，Control 代表新鲜培养基组，conditioned medium代表培养过 C6 细胞的条件培养基组。A：小室下为不同培养基时 BMSC 通过 transwell 小室人工基膜的基底层后染色，在显微镜下的图片，a 代表小室下为新鲜培养基时 BMSC 迁移后染色，显微镜下的图片；b 代表小室下为培养过 C6 细胞的培养基时，BMSC 迁移后染色，显微镜下的图片。B：BMSC 在不同培养基下迁移通过基膜的细胞数的统计图，结果以均数±标准差表示（n=5），conditioned medium 组与 Control 组相比存在显著差异以*** P <0.001 表示。3.3 C6 和 BMSC 导入 HSV-tk 的转染效率C6 细胞和 BMSC 细胞均导入空载质粒（ex-NC）和 TK 质粒（ex-TK），转染后48 小时分别在显微镜的同一视野计数各自在荧光下带有荧光标记的细胞数和在正常光源下的细胞数，根据两者的比值计算出各自的转染效率，每种细胞随机选取 5个视野计数。如图 3A 所示：C6 细胞转染后在荧光下观察带光的细胞数比 BMSC
图 3 C6 细胞和 BMSC 细胞的转染效率。A：C6 细胞和 BMSC 细胞转染 ex-NC（空载质粒）和ex-TK（TK 质粒）后在荧光下的图片，a 代表 C6 转染 ex-NC 的图片；b 代表 C6 转染 ex-TK 的图片；c 代表 BMSC 转染 ex-NC 的图片；d 代表 BMSC 转染 ex-TK 的图片。 B：两种细胞转染效率的统计图，结果以均数±标准差表示（n=5），BMSC ex-NC 组与 C6 ex-NC 组相比存在显著差异以***P<0.001 表示；BMSC ex-TK组与 C6 ex-TK 组相比存在显著差异以***P<0.001 表示。3.4 C6-tk 细胞对 GCV 的体外敏感性CCK-8 分析法测定细胞存活率。如图 4A 所示，Control 组及 ex-NC 组随 GCV浓度的增大细胞存活率无明显下降，而 ex-TK 组的细胞存活率随 GCV 浓度增大出现明显的下降趋势。与 Control 组相比，GCV 浓度大于 0.1ug/ml 时 ex-TK 组的细胞存活率开始下降，当 GCV 浓度增至 10ug/ml 时细胞的存活率下降最为显著（P<0.001），而继续增大 GCV 浓度，细胞存活率再无显著下降（P>0.05）。如图 4B，C，D 所示：GCV 浓度为 0.3、1、10μg/ml 时，ex-TK 组的细胞存活率与 Control
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 燕学波;杜运华;吕安林;邢玉洁;胡朝晖;胡新君;岳峰;;大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定[J];实用医药杂志;2012年10期
本文编号：2797020
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/2797020.html
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