AMPK在小鼠慢性脑缺血中的作用研究

发布时间：2020-08-21 16:18

【摘要】：背景和目的脑小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)指累及小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉、小静脉等没有侧支吻合的解剖终末血管,导致的一系列临床、影像、病理综合征。有研究显示西方国家缺血性脑卒中患者中约25%为CSVD,国内约50%。脑小血管病变常导致脑内腔隙性梗死、白质变性、微出血、皮质下小梗死、脑萎缩等损害,患者常表现头晕、眩晕、步态障碍、认知功能减退等症状。目前脑血管病的动物模型大多为急性脑缺血模型,慢性脑缺血模型较少,尤其是稳定的CSVD动物模型。构建一种模拟临床CSVD患者的慢性脑缺血动物模型,对于CSVD的发病机制及治疗研究具有重要的意义。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK))是细胞能量代谢调节器。大多数研究表明AMPK在急性脑缺血时被激活,脑ATP消耗加速,从而加重脑缺血损伤,尤其是缺血半暗带区的损伤。而在慢性脑缺血过程中,AMPK的作用机制尚不明确,有人认为,AMPK激活在慢性脑缺血中起脑保护作用,也有人认为其会加重慢性脑缺血损伤。本课题通过观察AMPK在慢性脑缺血中的作用并探索其作用机制,为寻找CSVD更有效的治疗靶点提供新思路。方法1、采用内径0.18mm的微弹簧套扎3月龄雄性C57BL/6小鼠的双侧颈总动脉,造成双侧颈总动脉狭窄(Bilateral common carotid artery stenosis,BCAS),实现小鼠慢性脑缺血,术中监测脑血流。假手术组仅分离小鼠双侧颈总动脉,不套微弹簧。术后1个月和3个月,采用Morris水迷宫等方法检测小鼠的认知功能。处死前进行头颅核磁共振(Magnetic resonance imaging,MRI)检查,取脑组织行石蜡固定,切片染色检测组织学改变。2、BCAS术后小鼠每天用AMPK激动剂二甲双胍(Metformin,Met)(按照250mg/kg剂量)灌胃。灌药后1月和3月行Morris水迷宫等行为学检测。处死前进行头颅MRI检查,取脑组织行石蜡固定,切片染色检测组织学改变。3、采用Cre-loxp重组酶系统构建AMPKα2基因敲除小鼠,用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、Western blot、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)等技术验证基因敲除效果。3月龄雄性AMPKα2基因敲除小鼠行BCAS术,同法进行小鼠行为学和组织学检测脑损伤情况。结果1、微弹簧套扎小鼠双侧颈总动脉后,小鼠出现了学习记忆能力减退,并随着缺血时间延长而逐渐加重。小鼠脑组织出现了脱髓鞘、星型胶质细胞增生和少突胶质细胞减少、神经元凋亡等慢性脑缺血损伤改变。以上结果表明用微弹簧对小鼠行BCAS术可造成小鼠慢性脑缺血,成功制备小鼠慢性脑缺血模型。2、BCAS术后,用AMPK激活剂二甲双胍对小鼠进行灌胃,发现二甲双胍组小鼠的学习记忆能力减退较对照组小鼠轻,脑组织脱髓鞘、胶质细胞数增生和神经元凋亡也较对照组小鼠轻。表明激活AMPK可改善BCAS术制备的小鼠慢性脑缺血损伤。3、与BCAS术后的野生型(Wide type,WT)C57BL/6雄性小鼠相比,AMPKα2基因敲除的雄性小鼠术后学习记忆能力明显减退,脑组织慢性脑缺血损伤明显,尤其是胶质细胞明显增生。表明AMPK功能的缺失会加重小鼠慢性脑缺血损伤。结论1、微弹簧套扎双侧颈总动脉能够成功制备小鼠慢性脑缺血模型。2、激活小鼠AMPK活性具有抗慢性脑缺血损伤的作用。3、敲除小鼠AMPKα2基因功能会加重慢性脑缺血损伤。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743
【图文】：

仪(新加坡 BIO-RAD)发光成像系统（美国 Fluorchem）配制磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，l，14.4g Na2HPO4，2.7g KH2PO4,溶于 800m pH 值至 7.4,最后加蒸馏水定容至 1L。甲醛：40g 多聚甲醛，用 0.1MPBS 加热溶解，0.1MPBS 定容至 1L。和分组月龄清洁级 C57BL/6 雄性小鼠，筛选体重为 2rris 水迷宫筛选

图 2 小鼠双侧颈总动脉套扎微弹簧组小鼠小鼠同样方法分离双侧 CCA，不进行微弹监测1 月和 3 月分别进行 1 次 Morris 水迷宫检测（同交替和新奇目标识别检测。自发交替，Y 迷宫三个臂随机设为 1、2、3，老探索 5min，依次记录小鼠进入每个臂的顺序号、总交替数（含连续三个臂序号的三联串总次数能交替数（进入各个臂的总次数 2）×100％。新奇目标识别，Y 迷宫三个臂随机设为新奇臂（，其中新奇臂先用挡板隔离。老鼠由起始臂放入5min，4h 后，打开新奇臂，小鼠由起始臂放入，

分别为术后1月和术后3月的Morris水迷宫小鼠训练1-5天平均逃避较 平均游泳速度比较S术后1月和术后3月，Morris水迷宫第6天，假手术组和BCAS组小鼠度比较，反映小鼠术后的运动能力。假手术组和BCAS组小鼠术后1比较，差异无统计学意义（P>0.05）。术后3月，可看出BCAS组小速度较慢，但差异未达到统计学意义（P>0.05）（图4）。020406080100nsnsregaewsimmingspe(dcm/s）

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

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本文编号：2799597