【摘要】：背景缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉(颈动脉或椎动脉系统)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。我国是全世界卒中发病率最高的国家之一,现有脑卒中患者10×10~6例,其中约85%为缺血性脑卒中,这无疑给患者及社会带来沉重的负担和极大的痛苦。我国是人口大国,缺血性脑卒中发病率逐年攀升、且复发率高于全球平均水平,严重影响了国民生存及生活质量。缺血性脑卒中的发病机制复杂,涉及炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、Ca~(2+)超载、氧化应激损伤等多种机制。越来越多的研究显示,炎症反应在缺血性脑卒中的发生、进展及转归中起着重要的作用,炎症反应可诱导神经元凋亡、破坏血脑屏障的完整性以及加重脑组织水肿等,因此,减轻炎症反应,防治炎性损伤已成为改善缺血性脑卒中预后的研究方向和治疗策略。脂氧素(lipoxins,LXs)是机体在炎症反应中产生的一种内源性脂质介质,具有强大抗炎、促炎症消退的作用。近年来一些研究初步显示LXA4对缺血性脑卒中有保护作用,但其作用的内在机制和确切环节尚不清楚。研究发现,小胶质细胞在缺血性脑卒中的炎症反应中起着重要作用,小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞,在缺血性脑卒中后可被迅速激活,激活后的小胶质细胞主要存在M1型和M2型两种极化状态,分别发挥促炎及抗炎双重作用。在缺血性脑卒中发病过程中LXA4是否能够调控小胶质细胞的极化进而达到抗炎和减轻炎症损伤作用及其相关机制尚不清楚,至今未见相关研究报道。本研究拟从动物和细胞水平研究LXA4对脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞极化的影响,并初步探讨其可能的机制,旨在为临床治疗缺血性脑卒中提供新的思路,为LXA4治疗缺血性脑卒中提供新的依据。目的1.观察LXA4在脑缺血再灌注损伤过程中的抗炎及神经功能保护的作用。2.阐明LXA4对脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞极化的影响。3.探讨LXA4对脑缺血再灌注损伤过程中对小胶质细胞极化调控的分子机制。方法1.体内运用改良的线栓法构建大鼠大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注损伤模型,模型建立后立即通过侧脑室注射LXA4进行干预,缺血2小时后拔出线栓实现再灌注,在既定的时间点进行后续的实验。2.体外培养BV-2小胶质细胞,构建氧糖剥夺/复氧(Oxygen sugar deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型并给予LXA4预处理,氧糖剥夺处理BV2小胶质细胞6小时,复糖复氧12小时后进行后续的实验。3.通过Longa法进行神经功能学评分、TTC染色观察脑梗死及水肿体积的大小、HE染色观察梗死的损伤程度及病理变化及TUNEL染色观察梗塞灶周围神经元凋亡的情况。4.免疫荧光观察激活后小胶质细胞的形态变化。5.RT-PCR和ELISA分别检测炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达情况。6.RT-PCR、Western-blot和免疫荧光分别检测iNOS和CD32(M1型极化标志物)、Arg-1和CD206(M2型极化标志物)的mRNA和蛋白表达情况。7.RT-PCR和Western-blot检测Notch信号通路相关的Notch-1、Hes-1及Hes-5的mRNA和蛋白表达情况。结果1.在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型中,通过行为学评分、TTC染色、HE染色及TUNEL染色,明显观察到侧脑室注射LXA4可显著降低大鼠神经行为学评分、梗死和水肿体积、神经元坏死及凋亡。2.Iba1免疫荧光结果显示,静息态的小胶质细胞呈现小胞体,高度分枝状,激活后的小胶质细胞胞体变大,突起变短,呈球状的“阿米巴状”,LXA4干预后可轻度抑制小胶质细胞的激活,但大多数细胞形态仍呈“阿米巴状”。3.体内大鼠MCAO后24h和体外BV2小胶质细胞OGD/R12h后,IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),LXA4进行干预后,IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达量均下降(P0.05)。4.体内大鼠MCAO后第3天和体外BV2小胶质细胞OGD/R12h后,M1型Marker(iNOS、CD32)和M1型Marker(Arg-1、CD206)的mRNA及蛋白表达量均升高(P0.05);LXA4干预后,M1型Marker CD32的mRNA及蛋白表达量均下降(P0.05),M1型Marker iNOS的蛋白表达量下降(P0.05),mRNA的表达量无明显变化(P0.05),M2型Marker(Arg-1、CD206)的mRNA及蛋白表达量均升高(P0.05);体外BV2小胶质细胞OGD/R12h后iNOS和Arg-1、CD32与CD206的免疫荧光双染结果与上述一致。5.体内大鼠MCAO后第3天和体外BV2小胶质细胞OGD/R12h后Notch信号通路相关蛋白Notch-1、Hes-1和Hes-5的mRNA和蛋白表达量均升高(P0.05),LXA4干预后,Notch-1和Hes-1的mRNA和蛋白表达量下降(P0.05),Hes-5的mRNA和蛋白表达量升高(P0.05)。结论1.LXA4可降低大鼠脑缺血再灌注损伤后梗死体积并减轻其神经功能损伤。2.LXA4可抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后及体外培养的氧剥夺复氧后的BV2小胶质细胞的炎症反应和炎症因子的表达。3.LXA4可调控脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织中的小胶质细胞及体外培养的小胶质细胞的极化,抑制其向M1型极化、促进其向M2型极化。4.LXA4对脑缺血再灌注及氧剥夺后复氧的小胶质细胞极化的调控可能是通过Notch信号通路实现的。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743
【图文】：
用介导的[2, 10, 11]。Notch 受体表达于细胞膜表面，因此可被解联蛋白和酶（ADAM）17 或-10 和早老素依赖性 γ-分泌酶复合物切割。切割后位至细胞核，并与转录因子 CSL 相互作用，从而激活下游靶基因[12CSL 单独存在时作为转录抑制剂来抑制靶基因的表达，但在与 NICD导相应基因的转录。
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本文编号：2805653
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