内分泌调控因子FGF21改善雄性2型糖尿病小鼠脑缺血预后的转化研究

发布时间：2020-08-27 12:44

【摘要】：目的缺血性脑卒中病理生理过程的复杂性和异质性,以及存在与其相关的多种合并症,使得目前临床中应用的各种神经保护药物缺乏有效的治疗效果。因此,发展出针对某一特定缺血性脑卒中患者亚群的靶向治疗药物已经成为缺血性脑卒中研究领域里的重要方向。2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)患者表现为一系列代谢异常,包括:高血糖、血脂异常及胰岛素抵抗。缺血性脑卒中合并2型糖尿病的患者不仅死亡率成倍提高,并且神经功能预后更差。然而临床中使用胰岛素控制血糖水平并不能够显著改善2型糖尿病患者缺血性脑卒中的预后,提示仅仅通过调控代谢稳态不足以有效治疗这部分患者。更多新近的研究证据显示糖尿病状态下各种其他途径也参与了缺血性脑损伤的加重,包括血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性增加、神经促炎症反应加重、神经退行性变以及认知功能损伤等。过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是一种重要的核内转录因子。它不仅参与调节机体糖脂代谢,在中枢神经系统各类细胞中也有表达,并且对缺血脑组织炎症反应具有重要调控作用。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,rFGF21)作为一种重要的内分泌因子,可通过调节PPARγ活性发挥其多种作用,包括强力的代谢调控、组织保护及促组织修复的功能。本研究旨在评估在小鼠缺血性脑卒中合并2型糖尿病模型中,给予重组人FGF21(recombinant human fibroblast growth factor 21,rFGF21)对于脑缺血后神经促炎反应以及预后的作用。方法本研究使用瘦素受体(Leptin receptor,Lepr)缺陷诱导的雄性2型糖尿病模型小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/J homozygous mice,db/db mice)及其对应的非糖尿病对照雄性小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/J heterozygous mice,db/+mice)。采用大脑中动脉远端永久性闭塞加90分钟同侧颈总动脉结扎法建立局灶性缺血性脑卒中模型(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)。手术后6小时给予首次背部皮下rFGF21或生理盐水注射,之后每天给予两次相同剂量背部皮下注射(rFGF或生理盐水,间隔时间至少8小时),直至处死。于脑缺血后相应时间点处死小鼠进行一系列相关检测,一共包括两个部分:1、糖尿病db/db小鼠共36只随机分为三组:假手术组(n=12)、生理盐水对照组(n=12),rFGF21治疗组(n=12)。非糖尿病对照db/+小鼠共24只随机分为两组:假手术组(n=12)和生理盐水对照组(n=12)。于第0(术前基础水平)天及术后第1、3、5、7、10、14天检测各组小鼠血糖及体重变化。于术前及术后第14天分别检测各组小鼠糖化血红蛋白水平。于手术后第14天取血清样品检测胰岛素水平及脂联素水平,取脑组织切片作苏木精伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)测量梗死体积大小,神经髓鞘固蓝染色(Luxol fast blue staining,LFB)测量神经髓鞘含量,免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)及非磷酸化神经丝重链(non-phosphorylated neurofilament H,SMI-32)含量。于第0、1、3、5、7、14天分别使用粘贴物移除测试、拉力测试、足错步测试及Y迷宫检测各组小鼠感觉运动功能以及认知功能。此外,实验还探究了rFGF21治疗对于非糖尿病db/+小鼠脑缺血后的可能作用,指标包括:血糖及体重、感觉运动功能及梗死体积。2、糖尿病db/db小鼠共54只随机分为三组:假手术组(n=18)、生理盐水对照组(n=18),rFGF21治疗组(n=18)。非糖尿病对照db/+小鼠共36只随机分为两组:假手术组(n=18)和生理盐水对照组(n=18)。手术后第3天收取梗死周边脑组织提取核蛋白检测转录因子PPARγ-DNA结合活性。于第7天收取梗死周边脑组织,采用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测促炎因子及抗炎因子的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)水平,包括:肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、CC类趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)、IL-4、IL-10、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。收取全脑采用免疫荧光检测梗死周边M1型小胶质细胞数量及M2型小胶质细胞数量。结果1、相对于非糖尿病对照组小鼠,2型糖尿病小鼠脑缺血后表现出更为复杂的病理特点,包括:全身代谢异常,神经功能缺损加重,梗死体积扩大和白质完整性破坏加重。rFGF21治疗显著改善2型糖尿病小鼠脑缺血后代谢异常及神经功能缺损,减小梗死体积,减轻梗死周边白质损伤及完整性破坏。rFGF21对于非糖尿病小鼠脑缺血后的梗死体积及神经功能预后改善不明显,但也不导致非糖尿病小鼠发生低血糖及体重下降。2、脑缺血后3天,损伤周边脑组织细胞核内PPARγ-DNA结合活性下降。相对于非糖尿病对照组小鼠,2型糖尿病小鼠脑缺血后损伤周边脑组织细胞核内PPARγ-DNA结合活性下降更为显著。脑缺血后7天,2型糖尿病小鼠梗死周边神经促炎反应更强,M1型小胶质细胞极化明显增加。rFGF21治疗显著提升损伤周边脑组织细胞核内PPARγ-DNA结合活性,减轻2型糖尿病小鼠脑梗死周边神经促炎反应及M1型小胶质细胞极化,并增加M2型小胶质细胞极化。结论rFGF21可能是一种新型的,基于疾病调修等多种作用的,针对缺血性脑卒中合并2型糖尿病的较为安全的候选治疗方案。rFGF21发挥上述治疗作用的机制可能是部分通过对系统性代谢进行调控以及促进与PPAR-γ活化相关的抗炎作用得以实现的。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3;R587.2
【图文】：

糖尿病小鼠,血糖,脑缺血,小鼠

间点上（术前基础水平，术后第）对小鼠分别进行了血糖（图.2）测试。糖尿病 db/db 小鼠的血糖和体重无论是基础水平值（O 过后的测值均明显高于非糖尿病对照 db/+小鼠（p<0.05），存在高血糖。rFGF21 连续治疗能够显著降低 db/db 小鼠 dMCAp<0.05），非 dMCAO 状态下，db/db 小鼠但是本实验所用 rF 小鼠体重并无明显影响。糖化血红蛋白的测定结果（图 1.2）也基础糖化血红蛋白值就明显高于 db/+小鼠（p<0.05）。而 dM/db 小鼠糖化血红蛋白测值也显著高于 dMCAO 后的 db/+小鼠（db 小鼠在 dMCAO 后存在持续的高血糖状态。而给予 rFGF21 治小鼠 dMCAO 后的糖化血红蛋白水平。肥胖是糖尿病 db/db 小鼠我们观察到 11 周龄左右的糖尿病 db/db 小鼠体重显著高于非糖（p<0.05）。dMCAO 后各组小鼠体重无明显变化，而长期接疗的 dMCAO 后糖尿病 db/db 小鼠体重无明显下降（图 1.3）。

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图 1.2 rFGF21 降低糖尿病小鼠脑缺血后糖化血红蛋白水平e 1.2 rFGF21 lowered the HbA1c level in diabetic db/db mice after d.$p<0.05 db/+ sham vs db/db sham,*p < 0.05 stroke vs sham,#p<0.05vs db/+ stroke,&p<0.05 db/db stroke+rFGF21 vs db/db stroke)图 1.3 rFGF21 对糖尿病小鼠脑缺血后体重无明显影响

糖尿病小鼠,脑缺血,糖化血红蛋白,后体

重庆医科大学博士研究生学位论文图 1.2 rFGF21 降低糖尿病小鼠脑缺血后糖化血红蛋白水平re 1.2 rFGF21 lowered the HbA1c level in diabetic db/db mice after dp.$p<0.05 db/+ sham vs db/db sham,*p < 0.05 stroke vs sham,#p<0.05vs db/+ stroke,&p<0.05 db/db stroke+rFGF21 vs db/db stroke)

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