脑缺血再灌注损伤后自噬的作用及BMSCs移植与自噬的关系探究
发布时间：2020-08-31 12:31
[背景]脑缺血是高发病率和高死亡率的主要病种,造成了医疗系统的巨大负担。成功溶栓或者血管再通后可能造成更严重的继发性脑组织损伤,即脑缺血/再灌注(I/R)损伤。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种具有自我更新、多向分化能力的非造血干细胞,可通过直接分化或者分泌可溶性因子等旁分泌过程来减轻脑缺血后组织损伤,促进神经功能恢复。最新研究表明,BMSCs的保护作用可能部分是通过调控自噬过程来实现的。自噬,是一个应激性溶酶体降解途径,可以通过消除细胞内错误折叠或聚集的蛋白质和受损细胞器来维持细胞质的稳态,在脑I/R损伤的发生发展中发挥着不可或缺的作用。同时,自噬也是一把双刃剑,自噬在脑I/R损伤中的作用以及与BMSCs移植的关系仍需进一步深究。[目的]探讨自噬在脑I/R损伤中的作用,以及BMSCs移植对脑I/R损伤大鼠神经功能恢复的影响,并进一步探索BMSCs移植与自噬的关联,进而为BMSCs移植应用于临床脑缺血患者的治疗提供更充分的理论依据。[方法]参照longa方法制备大脑中动脉缺血再灌注损伤(middle cerebral artery ischemia-reperfusion model,MCAO)模型。将造模成功的大鼠随机分配到假手术组,MCAO 组,MCAO+BMSCs 组,MCAO+3-MA 组,MCAO+BMSCs+LY294002组,并根据再灌注后时间点分为12h、24h、48h、3d、5d及7d亚组。采用mNSS神经功能障碍评分方法以及catwalk步态分析来进行I/R大鼠神经功能评估,应用透射电镜观察大鼠脑缺血区域细胞内超微结构变化及自噬体形成,Western blot检测各组大鼠脑组织中自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1、Akt/p-Akt以及mTOR/p-mTOR的表达,HE染色观察各组大鼠脑海马组织形态变化,并应用TUNEL检测各组的神经细胞凋亡情况,TTC染色技术检测大鼠脑梗塞面积的变化以及免疫荧光染色检测各组脑组织LC3表达的变化。[统计学方法]应用SPSS20.0统计软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料采用均数土标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组内进一步两两比较采用LSD-t检验,以p0.05示差异有统计学意义。[结果]1.自噬在脑I/R损伤中的作用:与空白组相比,脑I/R大鼠海马组织中可清晰地观察到自噬体形成,呈多层膜状结构,而且其海马组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比值以及Beclin-1表达明显增加(p0.05);与MCAO组相比,3-MA组于术后mNSS评分均明显降低,差异均有统计学意义(p0.05)。HE染色显示,3-MA组较MCAO组海马组织神经细胞损伤明显减轻,神经细胞坏死数目明显减少,差异有统计学意义(p0.05)。2.在脑I/R损伤中BMSCs移植与自噬的关系:①BMSCs移植可减轻脑I/R大鼠脑损伤,促进其神经功能恢复TTC染色结果显示,与MCAO组比较,MCAO+BMSCs组可明显减少脑梗死体积,差异有统计学意义(p0.05);TUNEL检测示脑I/R后12h至72小时,TUNEL阳性神经元逐渐增加,72小时达高峰,BMSCs组TUNEL阳性神经元百分比明显低于MCAO大鼠(p0.05);行为学结果分析示BMSCs+MCAO组较MCAO组大鼠mNSS评分降低,catwalk步态分析有明显改善,差异有统计学意义(p0.05)。②在脑I/R损伤中,BMSCs的神经保护作用与抑制自噬过程有关透射电镜下发现MCAO术后24h神经细胞内出现典型的自噬体,术后72h可见细胞内自噬体数量增多,并出现自噬溶酶体;脑I/R后脑组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1的表达量持续增加,移植后24h达高峰。而且,与MCAO组相比,BMSCs移植显著降低了 LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达,差异有统计学意义(p0.05);免疫荧光结果示在MCAO大鼠术后脑组织中LC3阳性细胞数明显增多(p0.05),而BMSCs移植则明显减少了 LC3的表达。③BMSCs在脑I/R损伤的保护作用是与PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活有关与sham组相比,脑I/R损伤减少了 p-Akt和p-mTOR的蛋白质水平,然而,在BMSCs+MCAO组中,p-Akt和p-mTOR表达水平显著增加(p0.05),LY294002的干预显著降低了 p-Akt 和 p-mTOR 表达(p0.05)。而 BMSCs+MCAO+LY294002组中,LC3Ⅱ/Ⅰ的表达相对于BMSCs+MCAO组增加,差异均具有统计意义(p0.05)。[结论]1、脑I/R损伤可引起激活自噬,抑制自噬后可以减缓脑I/R损伤大鼠脑组织破坏,并改善其神经功能障碍。2、BMSCs可以抑制神经元细胞的自噬,从而促进脑缺血再灌注大鼠神经功能的恢复。3、BMSCs的保护作用可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活来抑制自噬实现的。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.3
【部分图文】：
２、自嗤相关蛋白分子ＬＣ３与Ｂｅｃｌｉｎ－Ｉ的表达逡逑ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ－１在空白１组脑组织中均有少量表达，其中ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ－１在逡逑脑缺血再灌注损伤后６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的表达均增高（图２－３）。逡逑统计分析显示，与空白１组相比，除模型１组再灌注后７２ｈ亚组外，其他逡逑时间亚组ＬＣ３ＩＩ／Ｉ比值（代表自噬程度强弱）明显增加，差异有统计学意义（ｐ＜０．０５）；逡逑与模型１组再灌注后２４ｈ亚组比较，其他时间亚组ＬＣ３ＩＩ／Ｉ比值降低，差异有统逡逑计学意义0＜０．０５；）。对于Ｂｅｃｌｉｎ－１的表达，与空白１组相比以及其他时间亚组相逡逑比，模型１组再灌注后２４ｈ亚组Ｂｅｃｌｉｎ－１的表达明显增加，差异具有统计学意义逡逑（ｐ＜０．０５）。具体内容见表２－２。逡逑空白组邋６ｈ邋１２ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑ＬＣ３Ｈ邋ｉ邋ｔ：逡逑Ｉ－Ｃ３邋１逦—善逡逑Ｂｅｄｉｎ－１逦…逡逑！「逦s6y錝谩ⅰⅲу
本文编号：2808802
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.3
【部分图文】：
２、自嗤相关蛋白分子ＬＣ３与Ｂｅｃｌｉｎ－Ｉ的表达逡逑ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ－１在空白１组脑组织中均有少量表达，其中ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ－１在逡逑脑缺血再灌注损伤后６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的表达均增高（图２－３）。逡逑统计分析显示，与空白１组相比，除模型１组再灌注后７２ｈ亚组外，其他逡逑时间亚组ＬＣ３ＩＩ／Ｉ比值（代表自噬程度强弱）明显增加，差异有统计学意义（ｐ＜０．０５）；逡逑与模型１组再灌注后２４ｈ亚组比较，其他时间亚组ＬＣ３ＩＩ／Ｉ比值降低，差异有统逡逑计学意义0＜０．０５；）。对于Ｂｅｃｌｉｎ－１的表达，与空白１组相比以及其他时间亚组相逡逑比，模型１组再灌注后２４ｈ亚组Ｂｅｃｌｉｎ－１的表达明显增加，差异具有统计学意义逡逑（ｐ＜０．０５）。具体内容见表２－２。逡逑空白组邋６ｈ邋１２ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑ＬＣ３Ｈ邋ｉ邋ｔ：逡逑Ｉ－Ｃ３邋１逦—善逡逑Ｂｅｄｉｎ－１逦…逡逑！「逦s6y錝谩ⅰⅲу
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