UCA1通过抑制miR-204-5p上调ZEB1的表达促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化

发布时间：2020-09-02 16:23

　　目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,占全部神经系统肿瘤的60%以上~([1])。脑胶质瘤根据组织学亚型和恶性程度可分为星形细胞瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤等类型~([2])。尽管近年来胶质瘤的治疗方案在不断改进,但脑胶质瘤的预后仍不容乐观,患者中位生存期不到14个月~([3,4]),5年生存率仅为10%~([5]),成为困扰医学界的一大难题。因此,探索胶质瘤的病理机制有助于推动新型靶向治疗药物的开发,对有效治疗胶质瘤、延长患者的生存期具有重要意义。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白编码RNA。LncRNA通过选择性剪接、转录/翻译调控和表观遗传学~([6])等多个层面调控其下游基因表达。有研究表明LncRNA的异常表达与癌症的发生和转移相关~([7,8])。尿路上皮癌相关基因1(UCA1)最初在膀胱癌中被发现~([11]),有报道称UCA1在多种癌症组织中表达升高,如肺癌、结肠直肠癌、胃癌、口腔鳞癌和肾细胞癌等~([15-19]),并且UCA1在细胞增殖、凋亡、转移、耐药~([25])等多种细胞过程中发挥作用。近期发现,UCA1在胶质瘤临床样本中表达量显著升高,且预示着胶质瘤的不良预后~([26])。此外,UCA1在胶质瘤细胞中可促进细胞增殖、迁移、侵袭~([27])。然而,UCA1在胶质瘤发生、发展过程中的作用尚未完全清楚,UCA1对于胶质瘤细胞上皮间质转化的作用有待研究。上皮间充质转化(EMT)是肿瘤转移所必需的细胞过程,在此过程中,上皮细胞失去细胞之间连接,细胞骨架进行重构,失去上皮细胞表型,得到间叶细胞表型~([41])。ZEB1(zinc-finger E-box-binding homeobox 1)是上皮间质转化的重要调控基因之一,也是miR-204-5p的新靶点~([43,44])。已知在鼻咽癌细胞中,miR-204通过靶向抑制ZEB1,从而调控癌细胞EMT进程~([45])。此外,在多种癌细胞中,UCA1与miR-204相互作用以调控下游基因的表达,有报道UCA1通过miR-204-5p等靶基因(CREB和Sirt1)促进前列腺癌细胞和结肠直肠癌细胞的进展并增强化疗药物的耐受性~([34])。然而,UCA1是否通过miR-204-5p及其靶点调控胶质瘤的转移、侵袭和上皮间质转化过程目前尚无研究报道。本论文主要研究UCA1对脑胶质瘤细胞迁移和侵袭,以及上皮间质转化的调控作用,初步探讨UCA1/miR-204-5p/ZEB1轴对胶质瘤细胞上皮间质转化可能的分子调控机制。这些分子机制的阐明可能为脑胶质瘤的治疗提供新途径。研究方法:1.人脑胶质瘤细胞系U251、U87MG、SHG44及人胚肾细胞系HEK293T的培养。2.Real-time PCR检测人胶质瘤细胞系中UCA1的表达水平。3.构建UCA1的过表达质粒,向两株人胶质瘤细胞分别转染空载体(vector)和UCA1过表达质粒(UCA1),real-time PCR检测UCA1的表达量。4.划痕实验检测细胞迁移。5.Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。6.转染UCA1过表达质粒48小时后,Western blot法检测Fibronectin、COL5A1(collagen V)、ZEB1的蛋白表达变化。7.转染48小时后,免疫荧光染色检测Fibronectin和ZEB1的表达情况。8.Control,Vector,UCA1过表达质粒转染48小时后,real-time PCR检测miR-204-5p的表达水平变化。9.双荧光素酶报告基因实验验证miR-204-5p与UCA1特异性结合靶向调节。双荧光素酶报告基因实验分析miR-204-5p对ZEB1 3’-UTR区的靶向调节。10.胶质瘤细胞转染NC mimic、miR-204-5p mimic、NC inhibitor、miR-204-5p inhibitor,转染48小时后,Western blot法检测ZEB1的表达水平。11.胶质瘤细胞转染vector+NC mimic、vector+miR-204-5p mimic、UCA1+NC mimic、UCA1+miR-204-5p mimic。12.转染48小时后,Western blot法检测ZEB1的表达变化。双荧光素酶报告基因实验分析miR-204-5p与UCA1特异性结合后对ZEB1表达的调控作用。13.shRNA质粒的构建及稳定转染细胞的筛选。14.构建UCA1表达沉默的裸鼠皮下移植瘤模型。15.免疫组织化学分析和Western blot法检测肿瘤组织中Fibronectin、COL5A1、ZEB1的表达水平变化。结果:1.UCA1过表达促进SHG44和U87MG胶质瘤细胞的迁移和侵袭。2.UCA1过表达诱导胶质瘤细胞中EMT相关蛋白(Fibronectin、COL5A1、ZEB1)表达水平增加。3.UCA1过表达的SHG44细胞,miR-204-5p表达水平显著降低。双荧光素酶报告基因实验证实UCA1通过特异性结合位点靶向作用于miR-204-5p,调节miR-204-5p的表达。4.miR-204-5p靶向结合ZEB1的3’-UTR,并负性调控ZEB1的表达。5.UCA1通过特异性结合miR-204-5p,阻止miR-204-5p对ZEB1的靶向抑制,从而促进ZEB1的表达以及胶质瘤细胞上皮间质性转化。6.UCA1表达沉默的裸鼠皮下移植瘤组织中miR-204-5p表达量升高,Fibronectin、COL5A1和ZEB1蛋白表达水平降低。结论:实验证明了UCA1过表达增强了胶质瘤细胞的迁移、侵袭和细胞上皮间质转化能力。UCA1通过特异性结合miR-204-5p,上调ZEB1的表达,促进胶质瘤细胞的上皮间质转化过程。本研究表明UCA1/miR-204-5p/ZEB1是调节胶质瘤细胞转移侵袭的重要调控轴。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

划痕试验,过表达,转染,试验结果

16图 1 UCA1 过表达转染 U87MG 和 SHG44 细胞划痕试验和 Transwell 侵袭试验结果。(A) Real-time PCR 检测人胶质瘤细胞系(U251、U87MG 和 SHG44)中 UCA1 表达水平。(B)UCA1 过表达质粒 pEGFP-N1-UCA1 或空载体质粒转染胶质瘤细胞系(SHG44 和 U87MG)。采用 real-time PCR 检测 UCA1 表达水平，β-actin 作为内参因子。(C) 细胞划痕试验检测细

过表达,相关蛋白,免疫荧光染色,内参

18图 2 过表达 UCA1 对胶质瘤细胞中 EMT 相关蛋白（Fibronectin、COL5A1 和 ZEB 1）表达情况的影响。(A) UCA1 过表达质粒转染胶质瘤细胞 48h 后，Western blot 检测 SHG44 和 U87MG 细胞中Fibronectin、COL5A1 和 ZEB1 蛋白表达情况，β-actin 作为内参因子。(B) 免疫荧光染色检测各组 SHG44 细胞中 Fibronectin 和 ZEB1 的表达情况（×400）。结果用平均数±标准差表示。

序列,过表达,结合位点,荧光素酶报告基因

转染 UCA1 过表达质粒后，real-time PCR 检测 miR-204-5p 表达水平。如图3A 结果显示，UCA1 过表达的 SHG44 细胞与空载体对照细胞相比，miR-204-5p表达水平显著降低（P<0.01）。此结果说明 UCA1 过表达抑制了 miR-204-5p 的表达。使用生物信息学软件（Starbase）分析 UCA1 序列上存在 miR-204-5p 潜在的结合位点，结果如图 3B 所示。我们构建了含 miR-204-5p 潜在结合位点的野生型荧光素酶报告基因载体（UCA1-WT）和潜在结合位点突变的荧光素酶报告基因载体（UCA1-Mut），采用双荧光素酶报告试验证实 UCA1 与 miR-204-5p 的靶基因关系。结果显示，与 UCA1-WT 和 NC 转染的 HEK-293T 细胞相比，UCA1-WT与 miR-204-5p mimic 共转染的 HEK-293T 细胞荧光素酶活性显著降低（P<0.01）(图 3C)。表明 UCA1 是 miR-204-5p 的靶基因。相比之下，UCA1-Mut 和 miR-204-5pmimic 组与 UCA1-Mut+NC mimic 组的荧光素酶活性差异无统计学意义。以上结果说明 miR-204-5p 通过特异性结合位点靶向作用于 UCA1。

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