稳定表达EGFRvⅢ胶质瘤细胞株的建立

发布时间：2020-09-07 14:55

　　目的脑胶质瘤是成人最具侵袭性的恶性脑瘤,尽管传统治疗方式取得了一些进展,其难治性仍是临床困扰的问题,大量临床前实验及临床实验证实,免疫疗法是一种能够靶向杀伤肿瘤组织的特异性治疗手段。以表皮生长因子受体III(Epidermal growth factor receptor type III,EGFRvⅢ)为靶点的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)T细胞过继免疫疗法是治疗GBM的高效手段。与EGFR完整结构想比较,EGFRvⅢ的第二、第三、第四、第五、第六、第七个外显子被删除,导致801个碱基对的缺席,从而形成了新的甘氨酸密码子。在被翻译之后,胞外区6~273氨基酸被一个甘氨酸残基替代,最终形成了EGFRvⅢ,其特点是在正常组织中不表达,仅在肿瘤细胞中出现~([1]),而且是一种在包括脑胶质瘤在内的多数肿瘤中表达率极高的肿瘤特异性抗原,与肿瘤的许多恶性表型的出现密不可分,因此可当做合适的肿瘤治疗靶标,目前已经成为备受瞩目的肿瘤靶向治疗的分子靶点。EGFRvⅢ作为一个分子靶点,为胶质瘤的靶向治疗提供了新思路,本论文中构建的稳定表达EGFRvⅢ的U87细胞株,为胶质瘤的靶向治疗提供研究基础。方法首先EGFRvⅢ cDNA(2832bp)克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro的XbaI和NotI位点,引物中添加His6标签,测序鉴定;用磷酸钙沉淀法将含目的基因的质粒pCDH-CMV-EGFRvⅢ-EF1-puro与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.9和包膜蛋白质粒pVSV-G三质粒共转染293T细胞。过滤、浓缩包装好的病毒后,利用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的慢病毒感染U87细胞,嘌呤霉素筛选、有限稀释克隆培养建立稳定表达细胞株。Western blot采用人EGFRvⅢ单抗、His6单抗检测筛选的细胞株,流式细胞术检测EGFRvⅢ在U87细胞表面的表达。结果重组质粒pCDH-EGFRvⅢ经XbaI和NotI双酶切、1%琼脂糖凝胶电泳,产物与预期目的基因EGFRvⅢ cDNA(2832bp)大小一致;Western blot鉴定6株U87-vIII均表达EGFRvⅢ蛋白(145kd)和His6(145kd);流式细胞术检测2株U87-vIII细胞株(U87-vIII-2,U87-vIII-4)表面均表达EGFRvⅢ蛋白(分别为93.1%和96.9%)。结论稳定表达EGFRvⅢ的U87细胞株被成功建立,为胶质瘤靶向治疗研究提供了基础。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

酶切鉴定,片段基因,琼脂

结果H-EGFRvIII 的检测-EGFRvIII 经 XbaI 和 NotI 双酶切，酶切产物用 1%琼脂p和8kbp的两个片段，预期目的基因EGFRvIII cDNA分子-CMV-MCS-EF1-puro 的分子量为 7384dp，可见两个片段基因和载体大小一致（图 2.1）。DNA 测序分析结果与 N 列一致，双酶切和测序分析结果表明 V-EGFRvIII-EF1-puro 重组成功。

稀释浓度,显微镜观察,细胞的,细胞

图 2.2 免疫荧光检测 pCDH-CMV-EGFRvIII-EF1-puro 瞬时转染 293T 细胞的表达1 2 34 5图 2.3 病毒滴定测定显微镜观察部分不同稀释浓度的细胞

稀释浓度,细胞,嘌呤霉素,扩大培养

224 5图 2.3 病毒滴定测定显微镜观察部分不同稀释浓度的细胞病毒稀释浓度 1～5 依次为 10-1，10-2，10-3，10-5，10-73 Western blot 检测 EGFRvIII 表达鉴定结果LV-EGFRvIII 感染 U87 细胞，用嘌呤霉素筛选，抗性克隆扩大培养，获得 6株细胞：U87-vIII 1～6，提取感染之后的细胞的蛋白，用 Western blot 检测目的

【参考文献】