颞叶癫痫大鼠海马区CRMP-2蛋白的时空表达变化及其磷酸化调节

发布时间：2020-09-30 18:00

　　癫痫是神经系统常见的慢性疾病之一,约1/4为药物难治性癫痫,其中70%为颞叶癫痫。我们前期研究发现通过制备大鼠颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy,TLE)模型,发现海马神经元损伤,运用蛋白质组学技术将TLE大鼠海马组织与正常对照组及手术组进行比较,鉴定出一系列差异表达蛋白质,其中脑衰反应调节蛋白(Collapsion response mediator protein,CRMP-2)为下调最显著的蛋白质,提示其与TLE的发病密切相关。CRMP-2是CRMP家族5中亚型之一,主要表达于成人大脑的高度可塑性区域,如海马、嗅球和小脑。CRMP-2有促进轴突生长的作用,而磷酸化的CRMP-2失去促进轴突生长的作用。颞叶癫痫海马神经元损伤或抗损伤的过程中可能是通过CRMP-2及其磷酸化调控实现的。目的:观察CRMP-2在海人酸(KA)点燃癫痫大鼠模型中的海马的时空表达变化及其磷酸化调节,并探讨CRMP-2在颞叶癫痫海马神经元损伤或抗损伤过程中是通过其磷酸化作用调节实现的。方法:选取雄性Wistar大鼠64只,体重250-300g,采用海马杏仁核注射海人酸制备大鼠癫痫模型,将大鼠分为正常对照组(CONT)、假手术组(SHAM)、海人酸致痫组。通过Western Blot、免疫组织化学染色,检测致痫后不同时间点(3h、6h、24h、3d、7d、14d)癫痫大鼠海马CRMP-2及其磷酸化后的表达变化,并通过HE染色方法观察其病理变化结果:(1)HE染色观察致痫后海马的病理变化,CONT组和SHAM组的大鼠可见海马区锥体细胞及齿状回颗粒细胞形态正常,排列整齐,结构完整。与KA组相比,海马CA3区神经元细胞损伤最严重。KA致痫大鼠病理改变早期(3h)以神经元变性为主,可见细胞间质水肿。随后(6h)主要病理学改变是神经元坏死。随着病程进展,(24h、3d)海马神经元细胞发生明显的丢失或死亡,海马CA3区大片状坏死,多数细胞完全脱落消失,部分细胞收缩,核固缩、破碎、溶解,核仁消失,可见胶质细胞增生和毛细血管增多改变。最后(7d、14d)病情进一步加重,可见明显的神经元脱失,残存的神经元排列紊乱,细胞层基本消失,区域界限模糊,不同程度的胶质细胞增生。(2)Western Blot法检测KA致痫后大鼠的海马CRMP-2表达在3h、6h、24h、3d、7d、14d时间的变化是先升高后逐渐降低的,KA致痫后3h大鼠的海马CRMP-2的表达量迅速增多达高峰,但第14d略高于第7d。KA致痫后3h、6h、3d、7d、14d的CRMP-2的表达量与SHAM组相比较,有显著性差异(P0.05)。(3)Western Blot法检测KA致痫后大鼠的海马p CRMP-2表达在3h、6h、24h、3d、7d、14d时间的变化是先降低后逐渐升高的,海人酸致痫后大鼠海马p CRMP-2表达水平3h开始下降,6h达最低,随后逐渐升高。KA致痫后各时间点的p CRMP-2的表达量与SHAM组相比较,均有显著性差异(P0.05)。(4)免疫组织化学染色方法观察海马CA3、CA1、DG各区在假手术组、致痫后3h、6h、24h、3d、7d、14d的CRMP-2及p CRMP-2的表达,KA致痫后大鼠的海马CRMP-2表达在3h、6h、24h、3d、7d时间的变化为先升高后降低的趋势,但第14d较第7d是升高的。KA致痫后各时间点的CRMP-2的表达量与SHAM组相比较,有显著性差异(P0.05)。在海人酸致痫后3h、6h、24h、3d大鼠海马CA3区p CRMP-2表达的变化为降低的趋势,7d、14d略微升高。KA致痫后各时间点的p CRMP-2的表达量与SHAM组相比较,均有显著性差异(P0.05)。KA致痫后大鼠海马CA1、DG区CRMP-2及其p CRMP-2的表达在各时间点未见明显变化趋势。结论:(1)在癫痫组大鼠海马神经元损伤以CA3区为主,CA1、DG区细胞形态完整,排列整齐。因此,CA3区最容易出现神经元过度兴奋而致神经元死亡。(2)海人酸致痫后CRMP-2在大鼠海马组织表达变化为先升高后逐渐降低的趋势,而p CRMP-2(Thr514)是先降低后升高的趋势。(3)海人酸致痫后大鼠海马CRMP-2及其磷酸化蛋白表达水平存在时空表达差异,CRMP-2及其磷酸化可能参与了癫痫后神经元轴突生长的调节,在癫痫过程中可能与神经元损伤密切相关。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R742.1
【部分图文】：

模式图,立体定向手术,模式图,大鼠

图 3.1 大鼠立体定向手术模式图4）将预先装有 0.4ugKA(制备癫痫模型用）或等量 PBS(制备假手术组用）的微量注射器固定于定位仪上，使注射器尖端位于前囟，打开定位仪数字显示器并归零；按照《大鼠脑立体定向图谱》［58］（如图 3.1），将 BLA 坐标如下：纵轴在前囟后 2.5mm，右侧旁开 4.5mm，深度距颅骨表面 8.5mm；先使微量注射器的尖端位于前囟后 2.5mm 及中线右侧 4.5mm 处，用电钻钻一圆孔，直径为1.0mm，深度达硬脑膜表面，且不损及脑组织。5）将微量注射器沿钻孔进针，深度 8.5mm，调整微量注射器速度，使 KA或 PBS 缓慢、匀速地注射完毕，留置 10min 后缓慢退出注射器，注意避免进退针过快所致的溶液外溢而影响吸收效果。6）操作过程按无菌手术规则进行，注射后将少许青霉素粉涂在皮肤切开处，然后缝合切口，将大鼠单独放回笼中饲养，用摄像机进行行为学记录。

海人酸,海马

图 4.1 海人酸致痫组的海马与正常对照组的对比变化将大鼠海马各区在高倍镜下放大后，海人酸致痫后的不同时间点大鼠海马CA3 区神经元损伤严重，而海马 CA1、DG 区神经元细胞形态正常，排列整齐(见图 4.2、3、4）。分别计数进行定量分析(如表 1），发现大鼠致痫后海马 CA3 区神经元细胞存活数逐渐减少，而海马 CA1、DG 区神经元细胞存活数基本保持不变。表 4.1 海马各区神经细胞存活数（平均值±标准差）cont sham 3h 6h 24h 3d 7d 14d PCA1 68.67±2.0366.33±1.2072.33±1.8667.00±2.0873.01±0.5874.8±1.5370.67±0.8877.67±2.03>0.05CA3 26.33±0.3328.00±0.5818.33±0.3316.00±0.5811.67±0.589.33±0.587.67±0.334.33±0.33<0.05

海马,颗粒细胞,CA1区,细胞间质

观察 cont 组和 sham 组的大鼠海马 CA1 区锥体细胞结构完整，形态正常。致痫后的 3h、6h 大鼠海马 CA1 区细胞间质水肿较轻，而细胞形态基本正常，致痫后 24h、3d、7d、14d 海马 CA1 区细胞与 sham 组比较未见异常。

【参考文献】