α-硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注损伤影响及机制研究

发布时间：2020-09-30 19:01

　　目的脑缺血再灌注损伤是缺血性脑血管病造成神经功能缺损、致残乃至死亡的主要原因,目前没有有效的治疗方法,本研究通过建立大脑中动脉脑缺血再灌注动物模型,探讨α-硫辛酸对脑缺血再灌注损伤凋亡调控基因Bax m RNA和JNK3,及炎性因子NF-κB,TNF-α在蛋白和原位杂交水平上表达的影响,探讨药物干预后MMP-2、MMP-9的水平,血脑屏障通透性和脑组织含水量的情况,观察该药物对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法(1)根据经典Longa法制作大脑中动脉脑缺血再灌注损伤动物模型,假手术组不插入线栓。雄性SD大鼠随机分为假手术组(A组),脑缺血再灌注组(模型组,B组),α-硫辛酸预干预组(C组),根据再灌注时间不同又分为6h、12h、24h、48h 4个亚组。(2)α-硫辛酸于恢复再灌注前30分钟按照体质量20mg/kg进行腹腔注射,假手术组和模型组予以等体积生理盐水腹腔注射。(3)缺血2h后恢复再灌注并与各时间点采用Longa法评分标准进行神经功能评分,利用图像分析软件Scion Image进行脑梗死体积测定,TUNNEL技术检测神经元凋亡情况,免疫组织化学检测NF-κB、TNF-α,MMP-2、MMP-9利用原位杂交技术检测NF-κB m RNA、TNF-αm RNA、Bax m RNA,Western Blot方法检测JNK3蛋白表达水平。结果(1)与假手术组比较,模型组、α-硫辛酸预给药组在各时点凋亡调控基因Bax m RNA和JNK3蛋白的表达明显增高(P0.05)。与模型组比较,α-硫辛酸预给药组可改善24h、48h时点的神经功能缺损和减少各时点脑梗死体积(P0.05);亦能降低除6h时点以外的各时点凋亡调控基因Bax m RNA表达以及24h、48h时点JNK3蛋白的表达(P0.05)。(2)模型组与假手术组动物比较,模型组动物NF-κB表达在缺血再灌注6h后开始升高(P0.05),TNF-α表达在缺血再灌注24h后的表达开始升高(P0.05),缺血再灌注3d时两者均达到峰值(P0.05),而在缺血再灌注7d时仍高于假手术组(均P0.05);与模型组比较,α-硫辛酸预给药组于脑缺血再灌注24h、3d、7d时NF-κB和TNF-α表达降低;α-硫辛酸预给药组NF-κB各时点组内比较未见统计学差异(F=2.245,P0.05)。与模型组比较,α-硫辛酸预给药组梗塞体积明显减小,神经功能缺损评分降低(P0.05)。(3)与假手术组比较,模型组脑缺血再灌注后EB含量明显增高。与模型组比较,α-硫辛酸干预组各时间点EB含量明显减少,差异明显(P0.05)。模型组再灌注后24h可见MMP-2阳性细胞出现,3d~7d时达高峰,与模型组比较,α-硫辛酸预给药组MMP-2阳性细胞数各时间点均明显低于模型组。模型组缺血再灌注后MMP-9阳性细胞数12h明显增高,至2d达高峰,α-硫辛酸预给药组MMP-9阳性细胞数各时间点均明显低于模型组。结论(1)α-硫辛酸注射液预给药可抑制凋亡调控基因Baxm RNA及JNK3蛋白的表达,大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡减轻,脑梗死体积减小,神经功能改善,其抗凋亡机制可能与抑制Bax的表达和阻断MAPK-JNK3通路有关。(2)脑缺血再灌注损伤后炎性因子NF-κB和TNF-α高表达,α-硫辛酸预给药抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后炎性因子表达。α-硫辛酸可能是通过抑制NF-κB和TNF-α的表达,减轻脑缺血再灌注损伤引起的神经炎症,对脑缺血再灌注诱导的神经损伤具有明显的改善作用。(3)α-硫辛酸预给药能够明显降低缺血再灌后脑组织的EB含量,减轻BBB的开放,减少脑含水量,减轻脑水肿,对缺血性脑组织具有保护作用。其机制可能是通过降低MMP-2和MMP-9的表达,减轻炎性反应。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R743
【部分图文】：

正中切口,脑组织

7图 1.1 颈部正中切口图 1.2 手术视野图1.1.3.2 脑组织取材和组织切片制备大鼠经腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后，迅速暴露心脏，进行 0.9%氯化钠心尖灌注，再进行 4%多聚甲醛心尖灌注，充分固定后断头取出脑组织（见图 1.3，图 1.4）。将脑组织于视交叉吻合端到尾端进行片厚约 4μm 的冠状切片，将切片制成脑组织石蜡切片，用于 HE 染色、原位杂交染色和免疫组化实验。图 1.3 生理盐水心尖灌注图 1.4 充分固定后的脑组织1.1.3.3 神经功能评分采用 Longa 法于再灌注各时间点对动物进行神经功能评分。0 分：活动正常，无神经系统症状；1 分：左前肢在提尾时不能伸展；2 分：左侧 Honer 征，爬行时向左侧旋转；3 分：行走时向左侧倾倒；4 分：不能自主活动或意识丧失。得分为 1~4 分的动物表示脑缺血再灌注模型造模成功。1.1.3.4 脑梗死体积检测大鼠经脱颈处死后

脑组织,心尖,原位杂交染色,多聚甲醛

图 1.1 颈部正中切口图 1.2 手术视野图1.1.3.2 脑组织取材和组织切片制备大鼠经腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后，迅速暴露心脏，进行 0.9%氯化钠心尖灌注，再进行 4%多聚甲醛心尖灌注，充分固定后断头取出脑组织（见图 1.3，图 1.4）。将脑组织于视交叉吻合端到尾端进行片厚约 4μm 的冠状切片，将切片制成脑组织石蜡切片，用于 HE 染色、原位杂交染色和免疫组化实验。

心尖,生理盐水,脑组织

【参考文献】