P2Y12受体介导小胶质细胞活化在急性一氧化碳中毒迟发性脑病中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-10 00:49

　　 CO中毒是当今发生率和死亡率最高的中毒,尤其在我国北方地区意外生活性中毒中致死人数最多。在空气中浓度超过30mg/m3时能引起中毒。常见来源是工业中炼钢、炼焦以及以CO作为原料的化学工业、汽车排出的废气和火车通过隧道、矿井爆炸以及消防队救火、冬季火炉取暖门窗密闭等。内蒙古自治区地处北方高原地区,农牧区人口较多,供暖期较长,CO中毒及迟发性脑病更为常见。CO中毒后可以造成以中枢神经系统功能损害为主的多脏器病变,其中急性一氧化碳中毒迟发性脑病(Delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)是最常见且严重的并发症,发病率约为13~50%,死亡率可达31%。本病从急性期中毒症状改善到脑病发作(症状出现)之间有一段类似痊愈的时间,称假愈期。由于假愈期有一段类似痊愈的时间,往往易被患者及家属误认为治愈,因此,患者常常错过最佳治疗时间。DEACMP患者多数起病较急,临床症状较重,以痴呆症状为主,临床表现多样为特点。且具有较高的致残率和致死率,严重影响患者生存质量。一旦患者发生DEACMP,目前尚无有效的治疗手段和策略,给患者带来终生痛苦,给家庭和社会带来巨大负担,临床上迫切需要阐明DEACMP的发病机制,为临床早期干预和降低DEACMP事件的发生具有重要的临床意义。目前DEACMP发病机制尚未完全阐明。单纯缺氧学说不能完全解释其发病机制。众多文献研究显示脑组织损伤涉及早期损伤和二次损伤,损伤后脑内胶质细胞在数量和形态上发生了一系列变化,急性CO中毒及DEACMP的过程与脑损伤和二次损伤非常相似。而近年来的研究进展显示,从DEACMP存在“假愈期”的发病特点和病程早期的病理损伤表现来看,免疫学损伤机制更有可能合理解释这一疾病特点。而小胶质细胞是公认的中枢神经系统中重要的免疫效应细胞。目前,从这一角度研究CO中毒致病机理的报道甚少,如从这一方面进行突破研究,可能会有助于阐明DEACMP的发病过程,从而进一步解释DEACMP的发病机制,为临床检测、治疗和预防提供依据。既往研究发现CO中毒后静息态的小胶质细胞形态发生改变,与巨噬细胞形态相似,发生明显聚集,提示小胶质细胞变为活化状态。而我们前期研究发现,CO中毒后释放的炎症细胞因子攻击髓鞘碱性蛋白,使髓鞘碱性蛋白脱失继而引发脱髓鞘改变。而给予地塞米松治疗后,炎症细胞因子的释放及髓鞘碱性蛋白的脱失均明显受到抑制。但CO中毒后活化的小胶质细胞是否通过释放大量的炎性细胞因子继而引发慢性炎症反应,引起髓鞘碱性蛋白的脱失,最终介导DEACMP的发生,并且CO通过何种途径介导小胶质细胞活化值得我们进一步研究。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)及其水解产物二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)是维持机体细胞正常代谢所必须的能量载体,但同时也是一种重要的神经递质。P2嘌呤受体是ATP等嘌呤类物质的生理性受体,包括7种离子型通道P2X受体和13种G蛋白耦联P2Y受体。其中P2Y12受体是P2Y受体家族中的重要一员,广泛表达于中枢神经系统内,阳性细胞以小胶质细胞为主。有研究报道多种伤害性刺激均可引起ATP释放,ATP和水解产物ADP均可活化小胶质细胞。而Haynes学者在大脑皮质损伤小鼠模型中,发现在损伤组织释放的ATP刺激下,P2Y12受体激活从而使小胶质细胞活化,并在P2Y12受体基因敲除模型中发现小胶质细胞形态没有发生明显变化,提示P2Y12受体的激活在小胶质细胞活化过程中具有重要作用。基于目前各种研究学说在解释DEACMP的发病机制均存在一定局限性。结合已往学者的文献报道和我们的前期研究结果。因此本研究通过建立DEACMP大鼠模型并给予P2Y12受体抑制剂,应用水迷宫实验评价认知功能,应用高效液相色谱法、流式细胞仪检测法测定大鼠海马组织内ATP含量及小胶质细胞活化情况,进一步阐明DEACMP的发病机制,为该病防治提供新的思路和依据。第一部分一氧化碳中毒所致迟发性脑病大鼠模型的建立目的建立急性一氧化碳中毒迟发性脑病(DEACMP)大鼠模型,为探索其潜在机制提供实验对象。方法经Morris水迷宫训练合格的204只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组。实验组按照不同的中毒浓度再次随机分为1000ppm组、3000ppm组及4000ppm组。实验组分别通入浓度为1000ppm、3000ppm、4000ppm的一氧化碳(CO)气体40分钟(min)建立中毒大鼠模型。对照组通入空气。采用分光光度计法监测碳氧血红蛋白(COHb)含量,行Morris水迷宫实验评价认知功能,行HE染色观察海马组织细胞损伤情况。结果1.CO中毒后大鼠出现典型中毒表现。2.COHb含量与吸入CO浓度呈显著正相关(r=0.748,P0.05)。3.对照组及各实验组大鼠死亡率分别为0%、0%、40.74%、58.97%。4.Morris水迷宫实验结果显示:对照组和1000ppm组大鼠的逃避潜伏期中毒前后无变化,二组比较无差异。3000ppm组:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠的逃避潜伏期无变化,与对照组及1000ppm组比较无统计学意义(P0.05),第21d、28d,大鼠的逃避潜伏期延长,与对照组及1000ppm组比较均有统计学意义(P0.05)。4000ppm组:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠的逃避潜伏期无变化,与对照组及1000ppm组比较无统计学意义(P0.05),第21d、28d,大鼠的逃避潜伏期延长,与对照组及1000ppm组比较均有统计学意义(P0.05),与3000ppm组比较无统计学意义(P0.05)。5.HE染色结果显示:对照组及1000ppm组大鼠海马细胞排列有序,细胞结构完整;3000ppm组及4000ppm组大鼠在中毒后第21d、28d可见海马细胞数减少、细胞层变薄、细胞结构紊乱、细胞皱缩明显、结构不清,但未见明显坏死灶。结论静态吸入浓度为3000ppm的CO气体40分钟,21天后可以成功建立DEACMP大鼠模型。为本研究提供稳定、可靠的动物模型。第二部分小胶质细胞活化与DEACMP的相关性研究目的研究小胶质细胞活化与急性一氧化碳中毒迟发性脑病(DEACMP)的相关性。方法经Morris水迷宫训练合格的236只Wistar大鼠随机分为一氧化碳(CO)中毒组、DEACMP组和对照组。CO中毒组按照静态吸入浓度为1000ppm的CO气体40分钟建立CO中毒大鼠模型;DEACMP组按照静态吸入浓度为3000ppm的CO气体40分钟建立DEACMP大鼠模型。对照组通入空气。行Morris水迷宫实验评估认知功能,行HE染色观察海马组织细胞损伤情况,采用流式细胞仪分析小胶质细胞活化水平。结果1.CO中毒后大鼠出现典型中毒表现。2.Morris水迷宫实验结果显示:对照组和CO中毒组大鼠的逃避潜伏期中毒前后无变化(P0.05),二组比较无差异(P0.05)。DEACMP组:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠的逃避潜伏期无变化(P0.05),与对照组及CO中毒组比较均无统计学意义(P0.05),第21d、28d,大鼠的逃避潜伏期延长,与对照组及CO中毒组比较均有统计学意义(P0.05)。3.HE染色结果显示:对照组及CO中毒组大鼠海马细胞排列有序,细胞结构完整;DEACMP组大鼠在中毒后第21d、28d可见海马细胞数减少、细胞层变薄、细胞结构紊乱、细胞皱缩明显、结构不清。4.小胶质细胞活化水平结果显示:CO中毒组:CO中毒后第7d,小胶质细胞活化水平正常,与对照组比较无统计学意义(P0.05),第14d增高,与对照组比较有统计学意义(P0.05),第21d、28d降低,与对照组比较无统计学意义(P0.05)。DEACMP组:CO中毒后第7d,小胶质细胞活化水平正常,与对照组及CO中毒组比较均无统计学意义(P0.05),第14d、21d及28d明显增高,与对照组及CO中毒组比较均有统计学意义(P0.05)。结论1.大鼠海马组织小胶质细胞活化与DEACMP的发生发展具有相关性。2.CO中毒浓度不同,小胶质细胞活化状态不同。随着中毒浓度的升高,中毒时间的延长,小胶质细胞活化状态以经典激活状态(M1型)为主。第三部分P2Y12受体介导小胶质细胞活化在DEACMP中的作用目的研究P2Y12受体介导小胶质细胞活化在急性一氧化碳中毒迟发性脑病(DEACMP)中的作用。方法按照静态吸入浓度为3000ppm的一氧化碳(CO)气体40分钟建立DEACMP大鼠模型。将192只造模成功的大鼠按照随机数字表法分为干预组及DEACMP组,每组96只,另设对照组。干预组给予腹腔注射苏拉明;DEACMP组及对照组给予腹腔注射等剂量生理盐水。应用Morris水迷宫实验评价认知功能,行HE染色观察海马组织细胞损伤情况,采用高效液相色谱法、流式细胞检测法分析大鼠海马组织内三磷酸腺苷(ATP)含量变化及小胶质细胞活化情况。结果1.CO中毒后大鼠出现典型中毒表现。2.Morris水迷宫实验结果显示:对照组大鼠逃避潜伏期中毒前后比较无统计学差异(P0.05);DEACMP组:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠逃避潜伏期无变化,与对照组比较无统计学意义(P0.05),第21d、28d,大鼠逃避潜伏期延长,与对照组比较有统计学意义(P0.05);干预组:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠逃避潜伏期无变化,与对照组及DEACMP组比较无统计学意义(P0.05),第21d、28d,大鼠逃避潜伏期延长,介于对照组和DEACMP组之间,与两组比较有统计学意义(P0.05)。3.HE染色结果显示:对照组大鼠海马细胞排列有序,细胞结构完整;DEACMP组大鼠在中毒后第21d、28d可见海马细胞数减少、细胞层变薄、细胞结构紊乱、细胞皱缩明显、结构不清;干预组病理学改变介于两组之间。4.小胶质细胞活化水平结果显示:DEACMP组:CO中毒后第7d,小胶质细胞活化水平未增高,与对照组比较无统计学意义(P0.05),第14d、21d及28d明显增高,与对照组比较均有统计学意义(P0.05)。干预组:CO中毒后第7d,小胶质细胞活化水平未增高,与对照组及DEACMP组比较均无统计学意义(P0.05),第14d、21d及28d增高,但介于两组之间,与两组比较均有统计学意义(P0.05)。5.ATP含量结果显示:DEACMP组:CO中毒后第7d,海马组织内ATP含量未增高,与对照组比较无统计学意义(P0.05),第14d、21d及28d明显增高,与对照组比较均有统计学意义(P0.05)。干预组:CO中毒后第7d,海马组织内ATP含量未增高,与对照组及DEACMP组比较均无统计学意义(P0.05),第14d、21d及28d明显增高,与对照组比较有统计学意义(P0.05),但与DEACMP组比较无统计学意义(P0.05)。结论ATP可通过P2Y12受体途径介导小胶质细胞活化,活化的小胶质细胞其功能发生改变并分泌多种炎症刺激因子进而参与了DEACMP的发生发展。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R595.1;R747.9
【部分图文】：

图 1 大鼠急性 CO 中毒表现Fig. 1 manifestations of acute CO poisoning in ratsA：中毒前大鼠无明显异常变化；B：中毒 10min，大鼠出现烦躁、多动、不表现；C：中毒 30min，大鼠活动减少、四肢瘫软、呼吸急促、皮毛乍起、肢端口周皮肤呈樱桃红色，部分发生抽搐及昏迷；D：中毒 40min，将大鼠移出中毒，大鼠中毒浓度加深，部分死亡。.2 各组大鼠 COHb 含量各组大鼠中毒后 15min 血 COHb 含量均升高，1000ppm 组 COHb 含量波动于6.32～22.92%之间；3000ppm 组及 4000ppm 组 COHb 含量波动于 32.13～75.65%间。随着中毒时间的延长，血 COHb 含量逐渐降低，4h 时中毒组大鼠血 COHb降至正常。COHb 含量与 CO 中毒浓度大小呈正相关(r=0.748，P<0.05)。结果见

图 2 各中毒组大鼠血 COHb 含量变化ig. 2 changes of COHb content in blood of rats in each poisoning group鼠死亡率的比较及 1000ppm 组大鼠均无死亡；3000ppm 组大鼠死亡率为 4大鼠死亡率为 58.97%。实验组大鼠死亡率两两比较均有统计结果见表 1。表 1 各组大鼠死亡率的比较Table 1 comparison of rat mortality in each group别 总鼠数(N)死亡鼠数(n) 死亡 32 0 pm 组 32 0 pm 组 54 22 40

Table 2 comparison of escape latency of morris water maze test in rats of each group：与对照组比较，*P<0.05，与 1000ppm 组比较，#P<0.05，与 3000ppm 组比较，※P<0.0.5 病理学检查结果普通光镜下见对照组大鼠脑海马细胞正常，排列整齐。中毒后 21d、28d000ppm 组和 4000ppm 组大鼠可见海马细胞数减少、细胞层变薄、细胞结构紊乱胞皱缩明显、结构不清，但未见明显坏死灶(图 3)。组别 中毒前 7d 14d 21d 28d对照组1000ppm 组3000ppm 组4000ppm 组17.3±3.6 19.3±5.8 23.2±6.7 19.6±5.3 20.6±6.116.9±5.9 19.6±7.7 22.6±14.3 18.6±7.8 19.6±7.017.3±3.9 20.9±8.9 21.7±9.3 41.7±16.4*#42.2±19.816.4±6.4 28.7±13.1 28.6±10.9 50.0±18.6*#48.2±12.5

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 张玲;潘杰;;高效液相色谱法测定小鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP的含量[J];中国医院药学杂志;2008年21期

本文编号：2834470