锌指转录因子SNAI2在miR-203的影响下通过上皮间质转化参与胶质瘤耐药机制的调节

发布时间：2020-10-11 20:31

　　 研究背景胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)在成人中是最常见的脑原发性恶性肿瘤,其确诊后的中位生存期仅为14个月。化学药物治疗(化疗)作为肿瘤辅助治疗的方式之一,能有效杀灭肿瘤细胞,抑制肿瘤生长及迁移,延长患者生存时间。然而,GBM极易出现化疗耐药现象而导致肿瘤复发,治疗失败。因此,GBM的化疗耐药性已成为近年来胶质瘤临床治疗急需解决的重要问题之一。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞失去细胞极性,丢失细胞间紧密连接和粘附连接,在形态学上发生向间质细胞表型的转变,并获得更强的迁移、侵袭、增殖以及抗凋亡能力的过程。在EMT过程中,肿瘤细胞脱离原发灶,侵入细胞外基质和基底膜,向远处器官发生转移,形成新的肿瘤病灶。有研究发现EMT与肿瘤化疗耐药密切相关。由此,探寻EMT与化疗耐药之间相关性的分子机制,对于发现新的肿瘤治疗策略意义重大。通过人基因表达谱芯片对胶质瘤耐甲磺酸伊马替尼细胞株U87AR和非耐药细胞株U87中21325个基因进行分析,结果发现U87AR细胞中包含锌指转录因子(SNAI2)在内的1050个基因表达上调,1120个基因表达下调。并且,免疫组织化学检测发现SNAI2在化疗后复发胶质瘤组织中的表达较原发胶质瘤组织中的表达增高。锌指转录因子SNAI2 (又称slug)是Snail超家族成员之一,通过与靶基因启动子上的E-box结合抑制蛋白转录,诱导EMT,使肿瘤细胞变得具有迁移性和侵袭性。最近的研究表明,SNAI2的异常表达参与肿瘤细胞迁移、侵袭、凋亡及血管生成等方面的调控,与肿瘤恶性程度密切相关。然而,SNAI2在胶质瘤耐药性中的作用目前国内外尚未见相关研究。微小RNA (microRNAs,miRNAs)是真核生物中发现的一类非编码RNA,作为重要的调控因子,其参与多种细胞的生物进程。MiRNAs与靶基因3'非编码区(3'-UTR)结合,主要通过转录抑制或降解转录产物,在转录和转录后水平调节靶基因蛋白的表达。MiRNAs在多种正常组织与肿瘤组织中的差异表达谱,表明miRNAs在肿瘤的分类和疗效预测中具有重要的意义。越来越多的研究表明miRNA在肿瘤细胞化疗耐药和EMT的过程中扮演着十分重要的角色。比如,在膀胱癌细胞中,miR-27a通过靶向作用于SLC7A11基因,逆转癌细胞对顺铂的耐药性。无独有偶,在人源小细胞肺癌中,miR-135a通过靶向作用于APC基因,调控癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。而且,最近的一项研究表明,在乳腺癌和肺腺癌细胞中miR-200家族参与调控由TGF-p及EMT诱导因子引发的EMT效应。尽管如此,miRNAs以及它们的靶基因在EMT过程中如何参与化疗耐药的调控,目前具体机制尚未清楚。我们前期采用miRNA芯片对比分析胶质瘤耐药细胞U87AR和非耐药细胞U87之间miRNAs的表达谱差异性发现：miR-203在胶质瘤耐药细胞株U87AR中的表达较敏感细胞株U87中降低。然而,关于miR-203在胶质瘤化疗耐药中的作用及其分子机制,目前尚未见相关研究报道。另外,cDNA基因芯片对比耐药细胞株U87AR和亲本细胞U87发现：EMT主要间质标记物(SNAI2、ZEB1和vimentin)在U87AR中的表达明显高于U87亲本细胞。生物信息学分析进一步发现SNAI2可能是miR-203的潜在靶基因。综上所述,我们推测EMT可能在SNAI2的调控下参与了胶质瘤耐药机制的过程。本课题的研究目的为探讨SNAI2在miR-203的调控下,可通过诱导EMT,参与胶质瘤耐药机制的调节。通过本项目研究,进一步丰富胶质瘤耐药的分子机制,为胶质瘤耐药的研究提供依据,为解决临床棘手的胶质瘤耐药问题提供一种新的治疗策略。材料和方法1.临床标本收集收集2010年12月至2013年10月间在南方医科大学附属南方医院、珠江医院以及三九脑科医院接受治疗的80例胶质瘤病人的临床资料及肿瘤组织标本。其中Ⅰ级星形细胞瘤9例,Ⅱ级星形细胞瘤13例,Ⅲ级星形细胞瘤7例和胶质母细胞瘤51例。而在51例胶质母细胞瘤病人中,16例为替莫唑胺化疗半年后肿瘤复发病例。组织标本手术切除后立即冰冻保存,并由病理科行病理学检查确诊。所有确诊后的胶质瘤组织标本放-80℃保存,部分行石蜡包埋供后续实验使用。本研究经珠江医院伦理委员会批准,并在其监督下收集病人相关资料,所有患者签署知情同意书。2.细胞培养人源胶质瘤细胞株U251和U87均从南方医科大学公共卫生学院获取。耐甲磺酸伊马替尼(Imatinib)细胞株U251AR和U87AR前期已成功构建并保存于南方医院中心实验室。采用含10%胎牛血清和20%青霉素/链霉素(双抗)的DMEM培养基,在37℃、5%二氧化碳以及饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验。为了维持细胞的多药耐药表型,U251AR和U87AR交替使用无药培养基和含甲磺酸伊马替尼(浓度为122 μg/ml)的培养基培养。实验前耐药细胞株至少在不含伊马替尼的培养基中培养2周。3.细胞转染细胞采用阳离子脂质体法进行瞬时转染。浓度均为100 nmol/L的miR-203模拟物(mimics)、拮抗剂(anti-miR-203)和阴性对照组,以及浓度均为60 nmol/L的SNAI2特异性短发夹干扰片段和阴性对照组,通过与Lipofectamine 2000及OPTI-MEMI混合后转染细胞。具体操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。而稳定转染则采用LipofectamineTM 2000将表达SNAI2的SNAI2-eGFP-N1-1载体及其空载质粒转染入胶质瘤细胞,通过浓度为500μg/mL的G418筛选阳性克隆细胞进行扩大培养,获得稳定表达SNAI2的细胞株。筛出的稳转细胞株经24小时培养后,可用于后续基因表达及功能试验研究。用于转染实验的RNA寡核糖核苷酸片段购自上海吉玛公司,其序列如下所示：RNA oligoribonucleotides SequencemiR-203 mimic 5'-GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3' 5'-AGUGGUCCUAAACAUUUCACUU-3'miR-203 mimic NC 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'miR-203 inhibitor 5'-CUAGUGGUCCUAAACAUUUCAC-3'miR-203 inhibitor NC 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'4. MiRNA基因芯片分析基因芯片在耐药细胞株U87AR和亲本细胞株U87中进行miRNAs表达谱分析。具体操作如下：按照说明书采用TRIzol (Invitrogen)和RNeasy mini kit (Qiagen)试剂盒抽提细胞总RNA。然后用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit (Exiqon)试剂标记样品,并放置于miRCURY LNA Array (Exiqon, version 11.0)进行杂交。而后在Axon GenePix 4000B扫描仪上进行扫描,并使用GenePix pro version 6.0读取信号强度值。最后我们选取耐药细胞U87AR和亲本细胞U87之间表达差异倍数在1.5倍以上的miRNAs作为后续研究对象.5.总RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR按照试剂说明书,总RNA通过TRIzol (Invitrogen)提取并分离。取上述RNA进行反转录和实时荧光定量PCR。miR-203表达水平的检测采用miRNAsqPCR Quantitation Kit试剂盒(吉玛公司),以及加入miRNAs特异性的反转录序列和内参U6等严格按照试剂盒的说明操作。按实时荧光定量RT-PCR试剂盒说明(TAKARA)检测SNAI2、ZEB1、E-cadherin和vimentin的mRNA表达水平。实时荧光定量PCR采用SYBR Green作标记,并在ABI7500仪器上运行。选取GAPDH或U6作为内参,三次独立重复实验后得到的数据运用公式RQ=2-△△ct的方法进行分析。由TAKARA公司设计合成引物序列如下所示：Gene Primer sequencesSNAI2 Forward:5'-TGGTTGCTTCAAGGACACAT-3' Reverse:5'-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3'ZEB1 Forward:5'-GGGAGGAGCAGTGAAAGAGA-3' Reverse:5'-TTTCTTGCCCTTCCTTTCTG-3'E-cadherin Forward:5'-CCCGGGACAACGTTTATTAC-3' Reverse:5'-GCTGGCTCAAGTCAAAGTCC-3'Vimentin Forward:5'-CCCTCACCTGTGAAGTGGAT-3' Reverse:5'-TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT-3'GAPDH Forward:5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' Reverse:5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'miR-203 Order from GenePharma:Lot No.91126N22U6 Order from GenePharma:Lot No.83008710426.免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达提取细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,再经10%SDS-PAGE电泳分离,用半干法电转移至PVDF膜上。然后,5%脱脂奶封闭1.5h,TBST洗膜后用相应的SNAI2、ZEB1、E-cadherin和vimentin单克隆抗体(Cell Signaling Technology) 4 ℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1：5000),常温下孵育2h,再洗膜后行ECL化学发光显影。GAPDH作内参使用,蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。7.双荧光素酶实验将miR-203位于SNAI2的3'非编码区的反应元件(野生型或突变型),克隆至荧光素酶报告基因下游的psiCheck2质粒。然后利用luciferase assay kit试剂盒(Promega)和GloMaxTM 96 Microplate Luminometer发光检测仪分别测定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。再以两者间活性的比值作为荧光素酶的相对活性,进行不同样品间的比较。8.细胞侵袭实验取对数生长期的细胞,用胰酶进行消化并吹匀成单细胞悬液。在铺好Matrigel胶的Tanswell上室中加入200μl细胞悬液(总的细胞数量为1×105),下室每室加600μ1含10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃温度及含5%二氧化碳的孵箱培养48小时。随后取出Tanswell上室,用PBS清洗,棉签轻轻擦去膜上室面的胶,4%多聚甲醛室温固定15分钟,PBS再清洗3次,每次5分钟,结晶紫染膜15分钟,PBS清洗干净,用刀片将膜从小室中剥离出来,将膜下室面朝上置于载玻片上,200倍视野下显微镜进行拍照。所有实验需重复3次以上。9.细胞划痕及流式细胞术实验以5×105/cm2的细胞密度接种于六孔板,置入37℃C孵箱培养12小时,使细胞散开生长至完全接触。更换无血清培养基培养24小时,让细胞处于饥饿状态。然后,在铺开的单层细胞上使用200μ1的枪头轻轻划一道痕,并用PBS洗净。加无血清培养基继续培养,随后用NIH Image J软件测量各个时间点时痕道的宽度。每次实验至少重复4次以上。流式细胞凋亡检测,采用Annexin V/Propidium Iodide Detection Kit试剂盒(KeyGEN),严格按照试剂说明操作。10.CCK-8法检测细胞药物敏感性以每孔1×104个细胞接种于96孔板中,瞬时或稳定转染后培养24小时,然后加入不同浓度(50至200 μg/mL)的甲磺酸伊马替尼(Imatinib)、依托泊苷(VP-16)和替莫唑胺(TMZ)3种化疗药物。常规培养48小时后,每孔加入新配制的CCK-8溶液10μl,置入细胞培养箱中继续培养4小时后终止培养。震荡1分钟后,在酶联免疫检测仪上选取450nm波长,测定各孔光吸收值。取每5个重复孔的光吸收值(A值)的平均值,计算各种转染细胞在不同浓度的3种化疗药物下的存活率；细胞存活率=(实验组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)×100%。每次实验重复三次,取平均值,分别计算出3种化疗药物的IC50值。细胞增殖活性分析：细胞悬液终体积为100μl,细胞数2×103每孔,接种于96孔板。用加了替莫唑胺的培养基(50 μg/mL)分别培养细胞24、48、72、96和120个小时。随后按照试剂说明书采用CCK-8法检测细胞的生长活性。11.免疫荧光免疫荧光实验按照标准实验步骤进行操作。简而言之,细胞用4%的多聚甲醛进行固定,0.5%的Triton X-100通透细胞膜以及10%的羊血清进行封闭。细胞孵育相应一抗后40C过夜,PBS洗3次,每次5分钟,继续孵育带有荧光的二抗1小时,再次PBS洗3次,每次5分钟,用DAPI染核15分钟后,PBS清洗3次,每次5分钟。最后将细胞放置于倒置荧光显微镜下观察或拍照。12.免疫组织化学将胶质瘤组织进行石蜡包埋,切片后固定于载玻片上。随后石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶及血清封闭。SNAI2和E-cadherin的特异性单克隆抗体孵育浓度为1：200,4℃孵育过夜。每张玻片滴加带有生物素标记的羊抗兔IgG二抗(1：500),室温孵育1小时,PBS洗3次,每次5分钟。每张玻片滴加新配制的DAB溶液,显微镜下观察或拍照。最后,使用中性树胶封片保存。结果判定：SNAI2和E-cadherin阳性染色时呈棕黄色。13.统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件和GraphPad Prism5.0软件进行分析处理。所有实验重复3次,定量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组间的比较采用独立样本t检验。实时荧光定量PCR、免疫印迹、细胞侵袭实验、双荧光素酶实验多组间的比较采用完全随机设计的方差分析。方差齐,进一步的多重比较采用LSD法；方差不齐则采用Dunnettn's T3法。临床胶质瘤标本组间miR-203表达水平的比较采用Mann-Whitney test统计分析方法。SNAI2和miR-203表达水平的相关性采用Pearson相关分析。MiR-203表达水平与病人生存率的关系采用Log rank法分析。所有实验P值小于0.05表示差异有统计学意义。结果1.耐甲磺酸伊马替尼的胶质瘤细胞与EMT的关系1.1前期已成功构建的耐甲磺酸伊马替尼的胶质瘤细胞(U251AR和U87AR)对依托泊苷(VP-16)和替莫唑胺(TMZ)具有交叉耐药的特性。在形态学方面,U251AR和U87AR细胞失去细胞极性,丢失细胞间紧密连接和黏附连接,呈松散的长梭形间质细胞形态。通过qRT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测EMT主要上皮标志物(E-cadherin)和间质标志物(ZEB1、Vimentin)在耐药细胞株及其相应亲本细胞中的差异表达。我们发现：E-cadherin. ZEB1和Vimentin在U251AR中的表达与U251中：(1)mRNA的表达差异具有统计学意义(t=28.238, P0.001)、(t=-4.799, P=0.003)、(t=-9.906, P0.001),表达量分别是U251中的(0.13±0.04)、(3.71±0.41)、(2.15±0.37)倍。(2)蛋白水平的表达差异亦有统计学意义(t=27.678, P0.001)、(t=-14.030, P0.001). (t=-19.856, P0.001),表达量分别是U251中的(0.19±0.02)、(6.11±0.53)、(2.80±0.33)倍。同样,在U87AR及其亲本细胞U87中检测上述各基因mRNA和蛋白水平的表达。结果提示：E-cadherin、ZEB1和Vimentin在U87AR中的表达与U87中：(1) mRNA的表达差异亦有统计学意义(t=14.003, P0.001)、(t=-52.019, P0.001)、(t=-11.662, P0.001),表达量分别是U87中的(0.30±0.02)、(5.96±0.53)、(2.13±0.29)倍。(2)蛋白水平的表达差异有统计学意义(t=61.417, P0.001)、(t=-114.311, P0.001)、(t=-80.766, P0.001),表达量分别是U87中的(0.31±0.03)、(6.26±0.44)、(2.31±0.28)倍。这与前期的基因表达谱芯片结果一致,从而表明U251AR和U87AR细胞发生了EMT的转变。1.2细胞transwell侵袭实验结果表明,耐药细胞株U251AR和U87AR的侵袭能力较相应的敏感株U251和U87显著增强(t=-18.417, P0.001; t=-11.669, P0.001),。通过CCK-8法检测胶质瘤细胞的增殖能力,我们发现U251AR细胞在48,72,96和120小时的增殖能力均高于U251细胞,差异有统计学意义(t=-6.132, P=0.004;t=-12.463, P0.001;t=-6.379, P=0.003; t=-5.033, P=0.007);U87AR细胞在48,72,96和120小时的增殖能力均高于U87细胞,差异有统计学意义(t=-2.885, P=0.045;t=-9.175, P=0.001;t=-6.390, P=0.003; t=-20.310, P0.001)。2.MiR-203参与调节胶质瘤细胞EMT和化疗耐药性2.1我们前期通过miRNA基因芯片高通量筛选了胶质瘤耐药细胞U87AR和非耐药细胞U87之间miRNAs的差异表达谱,并应用实时荧光定量PCR验证筛选得到的差异表达基因。MiRNA芯片分析结果显示,相对于亲本细胞U87,14个miRNAs在耐药细胞U87AR中表达显著上调,而包括miR-203在内的11个miRNAs表达显著下调。实时荧光定量PCR提示miR-203在U87AR细胞中的表达较U87细胞下调5.80倍,差异有统计学意义(t=6.439,P=0.001),进一步验证了芯片的结果。2.2我们将miR-203模拟物(mimics)和抑制剂(antagomir-203)转染至胶质瘤细胞,分别上调和下调细胞中miR-203的表达水平,观察miR-203对细胞药物敏感性的影响。结果提示：与对照组相比较,转染了miR-203的U251AR细胞对三种化疗药物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性增加,半抑制浓度(IC50值)显著降低(P0.001,P0.001,P0.001)；转染了miR-203的U87AR细胞对Imatinib、VP-16和TMZ的敏感性亦增加,IC50值显著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。相反,转染了antagomir-203的U251亲本细胞对上述化疗药物的敏感性降低,IC50值显著增大(P0.001,P0.001,P0.001)；转染了antagomir-203的U87细胞对上述三种化疗药物的敏感性亦降低,IC50值显著增大(P0.001,P0.001,P0.001)。上述结果表明：上调miR-203表达水平可增加胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,而下调miR-203表达则促进细胞产生抗药性。2.3为了进一步探讨上调miR-203表达水平是否可以逆转耐药细胞的EMT特性,我们对U251AR和U87AR细胞进行了miR-203转染。结果提示：转染了miR-203的耐药细胞形态学上发生了转变,表现为鹅卵石样上皮细胞特征,细胞聚集,粘附生长。Western blotting检测提示EMT上皮标志物E-cadherin在转染了miR-203的耐药细胞中上调,而间质细胞标志物ZEB1和Vimentin则下调。另外,transwell侵袭实验表明：与对照组相比较,上调miR-203的表达水平可显著降低U251AR和U87AR细胞的侵袭能力(P0.001,P0.001)；相反,下调miR-203的表达水平则可显著增加细胞的侵袭能力(P0.001,P0.001)。划痕实验检测细胞的迁移能力,结果提示,U251AR/miR-203和U87AR/miR-203细胞在24小时的细胞愈合率显著低于相应对照组细胞,差异具有统计学意义(P0.001；P0.001)；而U251 AR/anti-miR-203和U87AR/anti-miR-203细胞在24小时的细胞愈合率则显著高于相应对照组细胞(P0.001；P0.001)。我们还发现,与对照组相比较,上调miR-203的表达水平可诱导U251AR和U87AR细胞凋亡率增加,差异具有统计学意义(t=-3.307, P=0.030;t=-7.100, P=0.002)。2.4采用Mann-Whitney法评估临床胶质瘤患者miR-203的表达水平与性别、年龄及WHO肿瘤分级的相关性。结果提示：miR-203的表达水平与患者的年龄(Z=-0.989,P=0.323)和性别(Z=-1.075,P=0.282)无关,差异无统计学意义。而miR-203的表达水平与患者的肿瘤分级具有显著相关性(WHO Ⅰ-Ⅱ vs. WHO Ⅲ-Ⅳ, Z=-2.866, P=0.004)。3. SNAI2是miR-203的直接靶向基因3.1为了进一步研究miR-203调控胶质瘤细胞EMT和化疗耐药的分子机制,我们利用miRNAs靶基因预测数据库(miRTarBase、TargetScan和PicTar)分析寻找miR-203的可能靶基因。MiR-203与锌指转录因子SNAI2的3'-UTR具有互补结合位点,提示miR-203对SNAI2可能具有靶向调控作用。并且,SNAI2与肿瘤EMT及耐药性具有一定的相关性,再结合前期基因芯片表达谱分析结果,我们选择SNAI2为候选靶向验证基因。3.2实时荧光定量PCR检测提示SNAI2在U251AR和U87AR细胞的表达水平较相应的亲本细胞显著上调(t=-18.696, P0.001;t=-14.567, P0.001)。并且,U251AR细胞转染了miR-203后,SNAI2的表达水平显著下调(t=6.240,P=0.003),差异有统计学意义；相反,U87细胞转染了antagomir-203后可显著上调SNAI2的表达水平(t=-3.143,P=0.035)。这些实验结果充分表明了miR-203直接作用于SNAI2,并抑制其表达。3.3我们还通过双荧光素酶实验进一步证实了miR-203与SNAI2的直接靶向调控作用。3.4为了进一步验证miR-203与SNAI2基因的靶向调控关系,我们检测了临床80例胶质瘤组织标本。结果提示：miR-203在胶质瘤组织的表达较正常脑组织低,而SNAI2则恰好相反,其在胶质瘤组织的表达水平较正常脑组织显著增高。此外,我们还对80例脑胶质瘤组织标本中miR-203和SNAI2 mRNA的表达水平进行了相关性分析,结果发现在胶质瘤标本中miR-203和SNAI2 mRNA的表达呈负相关性(r=-0.402,p=0.003)。该实验结果从临床方面进一步验证了miR-203对SNAI2基因的直接靶向调控作用。4. SNAI2与胶质瘤EMT及化疗耐药性的关系4.1由于miR-203与SNAI2的靶向关系,我们推测SNA12参与了胶质瘤细胞的EMT过程及化疗耐药性。我们将短发夹干扰RNA (shRNA)转染入U251AR细胞,下调SNAI2的表达。实时荧光定量PCR检测发现：转染sh-SNAI2的U251AR细胞,其SNAI2表达水平较阴性对照组显著下调(F=58.606,P0.001)；免疫荧光实验从蛋白水平进一步证实sh-SNAI2干扰有效。这表明合成的SNAI2干扰片段可有效下调SNAI2的表达。结果发现,SNAI2表达下调可增加耐药细胞U251AR对化疗药物Imatinib、VP-16和TMZ的敏感性,显著降低细胞对药物的IC50值(F=256.494, P0.001; F=1011.480, P0.001; F=93.796, P0.001)。此外,U251AR细胞下调SNAI2后,形态上由间质细胞形态向鹅卵石样上皮细胞形态转变。与对照组相比较,U251AR/shSNAI2细胞的侵袭和迁移能力显著下降(t=16.056, P0.001; t=8.163,.P=0.001)。Western blotting检测提示：下调SNAI2表达水平后,可引起EMT上皮细胞标志物E-cadherin上调,以及间质细胞标志物ZEB1和Vimentin的下调。以上结果表明,miR-203参与胶质瘤EMT的过程,是通过对SNAI2的调控实现的。4.2为进一步探讨在胶质瘤亲本细胞中过表达SNAI2是否可诱发EMT和化疗耐药性,我们构建了稳定过表达SNAI2的细胞株U87-pcDNA3.1-SNAI2。检测发现,U87-pcDNA3.1-SNAI2细胞株对三种化疗药物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性均显著降低(F=47.397, P0.001; F=79.328, P0.001; F=65.099, P0.001),并且细胞形态由紧密连接的上皮样细胞向松散的间质样细胞转变。同时,U87-pcDNA3.1-SNAI2细胞株相对于阴性对照组的细胞侵袭能力显著增强(t=-6.185,P=0.003),并伴随着上皮细胞标志物E-cadherin的下调,以及间质细胞标志物ZEB1和Vimentin的上调。此外,过表达SNAI2可以逆转miR-203对胶质瘤细胞EMT和化疗耐药性的抑制效果。5.MiR-203与临床胶质瘤患者生存期的关系5.1免疫组化法检测35例原发性和16例复发性(经替莫唑胺化疗6个月后)胶质母细胞瘤组织SNAI2和E-cadherin的蛋白表达水平发现：SNAI2在复发性胶质母细胞瘤组织中的表达水平高于原发性；相反,E-cadherin的表达水平在复发性胶质母细胞瘤组织中却降低。通过实时荧光定量PCR检测,SNAI2和E-cadherin mRNA在复发性胶质母细胞瘤组织中的平均表达水平分别是原发性肿瘤组织中的4.05和0.54倍,差异有统计学意义t=-3.838, P=0.018; t=4.282, P=0.013)。5.2实时荧光定量PCR检测提示miR-203在复发性胶质母细胞瘤组织中的表达水平低于原发性肿瘤组织(t--4.310,P=0.003)。而且,Log rank法分析结果表明：miR-203高表达的胶质瘤患者,其生存期较低表达的患者长(P=0.0017),预后好。结论1.耐甲磺酸伊马替尼的胶质瘤细胞(U251AR和U87AR)具有EMT的特性,其侵袭和增殖能力较相应的亲本细胞显著增强。2.MiR-203在胶质瘤耐药细胞株中呈低表达,上调miR-203可有效逆转胶质瘤细胞的EMT特性和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。SNAI2是miR-203的靶基因之一。MiR-203可通过靶向作用于SNAI2,调控胶质瘤的EMT和参与化疗耐药机制的调节。3. SNAI2在胶质瘤耐药细胞株中呈高表达,下调SNAI2可增加细胞对化疗药物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性并抑制EMT过程。而过表达SNAI2则促进胶质瘤细胞发生EMT转变,导致细胞对化疗药物的敏感性降低。SNAI2在胶质瘤组织中的表达水平,与化疗敏感性相关。并且,SNAI2参与胶质瘤化疗耐药可能是通过影响细胞的凋亡实现的。4.降低或增加SNAI2表达可以引起胶质瘤细胞侵袭和迁移能力相应的降低或者升高。5.MiR-203在复发性胶质瘤组织中低表达,且与临床患者的生存期及预后密切相关,miR-203可能作为胶质瘤独立的预后因子。综上所述,本课题的研究结果表明：SNAI2在miR-203的调控下,通过诱导EMT进程参与胶质瘤耐药机制的调节。SNAI2可能是胶质瘤化疗药物敏感性的可靠标志物之一。重新表达miR-203或下调SNAI2可有效抑制胶质瘤化疗耐药性。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

通过ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测胶质瘤细胞的侵袭能力。实验结果表明；Ｕ２５１ＡＲ??和Ｕ８７ＡＲ发生ＥＭＴ后，其侵袭能力商于相应的亲本细胞Ｕ２５１和Ｕ８７，差异有??统计学意义（户－１８．４１７，戶＜０．００１；／＝－１１．６６９，戶＜０．００１）（图１－化；表１－５；表??１－６）。??表１－５?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测Ｕ２５１和Ｕ２５１ＡＲ细胞的侵袭能力??Ｔａｂｌｅ?＾５?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｐｒｏｖｅｓ?孤?ａｌｔｅｒｅｄ?ｉｎｖａｓｉｖｅ?ｂｅｈａｖｉｏｒ?ｏｆ?Ｕ２５１ＡＲ?ｃｅｌｌｓ．?（了；ｔｓ，??ｎ＝５）??ｎ?细胞侵袭数目（个）??Ｕ２５１?５?６１．２００±４．４９４??Ｕ２５１ＡＲ?５?１３８．２００±８．１９８??Ｔｉ?－１８．４１７??户值?＜０．００１??表１－６?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测Ｕ８７和Ｕ８７ＡＲ细胞的侵袭能力??Ｔａｂｌｅ?＾６?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｐｒｏｖｅｓ?ａｎ?ａｌｔｅｒｅｄ?ｉｎｖａｓｉｖｅ?ｂｅｈａｖｉｏｒ?ｏｆ?Ｕ８７ＡＲ?ｃｅｌｌｓ．（玄±《，??ｎ＝５）??ｎ?细胞侵袭数目（个）??５?３６．０００±６．１２４??Ｕ８７Ａ?民?５?１０３．４００主?１１．３７１??Ｔｉ?－１１．６６９??戶值?＜０．００１??ＣＣＫ－８法检测细胞增殖能力的实验表明；经５０?ｎｇ／ｍｌ的替莫哇胺刺激后，??Ｕ２５１ＡＲ细胞在４８，?７２，?９６和１２０小时的増殖能力均高于Ｕ２５１细胞，差异有??统计学意义（ｆ＝〇．〇〇４

?相对于亲本细胞Ｕ８７，１４个ｍｉＲＮＡｓ在耐药细胞Ｕ８７ＡＲ中表达上调，而包括??ｍｉＲ－２０３在内的１１个ｍｉＲＮＡｓ表达则下调（图２－１Ａ，Ｂ）。??同时，我们采用实时巧光定量ＰＣ民检测胶质瘤耐药和敏感细胞株中ｍｉＲ－２０３??的表达水平，レッ进一步验证芯片的结果。采用／检验进行统计分析，方差齐性检??查示方差齐，Ｕ２５１ＡＲ中ｍｉ艮－２０３的表达较敏感细胞株Ｕ２５１显著降低，差异具??有统计学意义（户９．４４２，戶＜０．００１，图２－３Ａ）?；?Ｕ８７ＡＲ中ｍｉＲ－２０３的表达较敏??感细胞株Ｕ８７亦显著降低，差异具有统计学意义（户６．４３９，尸＝０．００１，图２－３Ａ）。??表明ｍｉＲ－２０３在胶质瘤耐药细胞中的表达下调，与ｍｉＲＮＡ芯片的结果一致。??Ｂ?ＮＵｃｒｏＲＮＡ?Ｆｏｌｄ?Ｃｈａｎｇｅ??ｈｓｎ－ｉ．．：＊＇：■?０．１４９??ｈｓａ－ｍｉＲ－３１?己?８－５。?０．１８５??－８．３?－１．：?１．８?ｈｓａ．ｍｉＲ＿４５３４?０．２５７??ｆ?ｆ?Ｖ?ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３?０．４２０??？．?ｙ

?第王部分?Ｍ化－２０３通过把向ＳＮＡ口调控胶质瘤ＥＭＴ和化疗耐药性???ＩＤ?：０?３０?４０?ＳＯ?６０?７０?６０?Ｍ?ｌＯＯ?１??■?．■■瞻垂—?？藝■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■？■■麵■■■■■誦■■禱■■？禱■■■■■麵??Ｃ?Ｔ?、－?｜二．ｆ．?Ｕ?Ｉ－．?．．?ＯＣ?了?．．?．?Ｃ。＜＂－Ｔ?ｔ?Ｃ?＜?Ｃ?Ｔ?．．?．．?Ｃ．?１：?Ｃ?Ｇ?．．?０?■?：?Ｃ．Ｔ?１＇．?ＣＴ?ｒ．?，?，?Ｃ．?ｔ．?〇｜：?：?Ｔ?ｒ?ｒ?．．?０?：?了?１＊?．?－?Ｉ：?Ｃ．?ｒ．巳?ｒ．?．?‘：?ｕ了?ｒ?ｉ：，?了?Ｇ?．?：?〇?广．〇?：?〇?了。Ｃ?Ｔ?ｉ—．广，。占?Ｃ?Ｔ?Ｔ，－?Ｃ??

本文编号：2837083