MicroRNA-182-5p在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-11 23:51

　　 研究目的和意义1.研究miRNA-182-5p和TLR4在OGD诱导的小胶质细胞中表达情况以及两者之间的调节关系;2.研究在OGD诱导的小胶质细胞中miRNA-182-5p对炎症反应的调节作用以及是否通过TLR4的介导;3.研究miRNA-182-5p是否对脑缺血再灌注大鼠产生神经保护效应;4.研究miRNA-182-5p对脑缺血再灌注大鼠的神经保护效应是否是通过调节TLR4介导的炎症反应;研究方法1.细胞实验:BV2细胞转染miRNA-182-5p的模拟物及抑制剂,经OGD处理后,RT-PCR及Western Blot检测miRNA-182-5p及TLR4的表达;BV2细胞转染miRNA-182-5p的模拟物后经OGD处理,RT-PCR及ELISA检测促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-1β的水平;BV2细胞转染siTLR4后经OGD处理,western blot检测TLR4的表达,RT-PCR检测促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-1β的水平;另外BV2细胞同时转染miRNA-182-5p的模拟物及TLR4(ORF),Western Blot检测TLR4的表达,RT-PCR检测促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-11β的水平。2.动物实验:连续三天静脉注射miRNA-182-5p模拟物,制作MCAO模型模拟脑缺血再灌注,TTC染色观察缺血面积,mNSS评分及foot-fault test检测神经功能;取缺血灶半暗带脑组织提取RNA及蛋白,RT-PCR及ELISA检测促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-1 β 的水平,RT-PCR及western blot检测TLR4的表达。研究结果1.在OGD诱导的小胶质细胞中miRNA-182-5p水平下调,TLR4表达上调BV2细胞经OGD处理,在0,3,6和12小时检测MicroRNA-182-5p水平发现随时间呈下降趋势,而TLR4 mRNA和蛋白水平随时间呈上升趋势。2.在OGD诱导的小胶质细胞中MiRNA-182-5p调节TLR4的表达BV2细胞过表达及敲减miRNA-182-5p,与对照组比较发现,TLR4 mRNA和蛋白相对水平降低及升高;经OGD处理后,与NC组比较发现,TLR4mRNA和蛋白相对水平降低及升高。3.TLR4是miRNA-182-5p的直接靶点HEK293和BV2细胞同时转染TLR4 3'-UTR野生型或突变型luciferase质粒及miRNA-182-5p mimics,较NC组,TLR4 3'-UTR野生型荧光素酶活性较弱(p0.05),而TLR4 3'-UTR突变型荧光素酶活性与NC组无明显差别。4.miRNA-182-5p抑制OGD诱导的小胶质细胞炎症反应BV2细胞过表达miRNA-182-5p且经OGD处理,与对照组比较,TNF-a,IL-6 and IL-1β的mRNA及蛋白相对值均明显降低。5.miRNA-182-5p通过TLR4介导抑制OGD诱导的小胶质细胞炎症反应BV2细胞转染siTLR4且经OGD处理,与NC组比较,TNF-a,IL-6 and IL-1β的mRNA相对值明显降低;而同时转染miRNA-182-5p及TLR4(ORF)质粒且经OGD处理后,与NC组比较,TNF-a,IL-6 and IL-1β的mRNA相对值明显升高。6.miRNA-182-5p抑制小胶质细胞TLR4的表达对脑缺血再灌注大鼠产生神经保护作用与NC组比较,miRNA-182-5p处理组脑缺血面积明显减小;mNSS及foot-fault test行为学评分显示,较NC组,miRNA-182-5p处理组从第7天开始有所改善,在第14、21及28天改变明显;较NC组,miRNA-182-5p处理组Ibal、TLR4阳性细胞明显减少。7.miRNA-182-5p抑制TLR4的表达来减轻脑缺血再灌注大鼠的炎症反应与NC组比较,miRNA-182-5p处理组TNF-a,IL-6 and IL-1β 的mRNA及蛋白表达相对值均显著降低,TLR4的mRNA和蛋白表达相对值降低。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743
【部分图文】：

??而ＴＬＲ４的转录与翻译的水平均明显升高（图１－１Ｂ、Ｃ）。??ＡＢＣ?丨丨丨丨！?一：｜??ｓｌｉｕｉ?ｉ：Ｕｉ?Ｑ??０３８?１２?０３６?１２?０３６?１２??ＯＧＤ｛ｈ）?〇ＧＤ?（ｈ）??图１－１?ＯＧＤ处理不同时间后小胶质细胞中ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ＴＬＲ４?ｍＲＮＡ和蛋白相对表达量。Ａ，??ｍｉＲ－１８２－５ｐ的相对表达量。Ｂ

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ｍｉＲ－１８２－５ｐ?后经?０ＧＤ?处理?ＢＶ２?细胞，ＲＴ－ＰＣＲ?检测?ＴＮＦ－ａ，ＩＬ－６?ａｎｄ?ＩＬ－１３?的??转录水平，结果显示较空白对照组，０ＧＤ处理后促炎因子水平显著升高，而在转??染ｎｉｉＲ－１８２－５ｐ后促炎因子仍处于较低水平（图２－２Ａ）；进一步我们通过ＥＬＩＳＡ??检测细胞培养上清促炎因子蛋白表达情况，结果显示ｍｉＲ－１８２－５ｐ组促炎因子蛋??白水平明显低于０ＧＤ对照组和ＮＣ组（图２－２Ｂ、Ｃ和Ｄ），以上数据说明ｍｉＲ－１８２－??５ｐ抑制０ＧＤ诱导的小胶质细胞炎症反应。??Ａ?Ｂ??１５１?■ＩＮＦａ?勹?＊??〇，?－ｇ?ＪＬＡ?Ｉ?Ｉ?ＩＬ－１Ｐ?＾４００－?ＪＸＬ?ＪＴ?１??ｉｉ－?？?ｋ?Ｉ?■??ｉ：Ｕｕ??ＯＧＤ?一?＋?＋＋?－?＋?＋＋?—?＋?＋?＋?ＯＧＤ?一?＋?＋?＋??ＮＣ?一?一＋—??＋——?—?＋?—?ＮＣ?一?一?＋?—??ｍｉＲ－１８２－５ｐ?—?一一＋?一一一?＋?一一—＋?ｍｉＲ－１８２－５ｐ?—一一?＋??Ｃ?Ｄ?＊??１２０－１?１００－ｉ?＊?，?，??！：ｉｒ?ｈｌｉ，??ｉｌｌＩｔ?ＪｔｌＸｌ??ＯＧＤ?一?＋?＋?＋?ＯＧＤ?－?＋?＋?＋??ＮＣ?—?一?＋?—?ＮＣ?一?一?＋?—??ｍｉＲ－１８２－５ｐ?－一一?＋?ｍｉＲ－１８２－５ｐ?—?一一?＋??图２－２?ｍｉＲ－１８２－５ｐ抑制０ＧＤ诱导的小胶质细胞炎症反应。Ａ，?ＲＴ－ＰＣＲ检测转染ｍｉＲ－１８２－５ｐ??或?ＮＣ?后经?０ＧＤ?诱导?ＴＮＦ－ａ
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本文编号：2837307