目的:重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是以神经肌肉接头传导障碍为特征的慢性自身免疫性炎性疾病。大约85%的MG患者伴有针对突触后膜乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor,ACh R)的自身抗体。T细胞、B细胞和细胞因子之间的相互作用在神经肌肉接头处的免疫炎性反应中起着重要的作用。白细胞介素(Interleukin,IL)-35是新发现的IL-12家族成员,通过抑制辅助性T细胞分化及炎症因子的释放,下调炎症反应。IL-35在MG中的作用尚不明确。本研究旨在通过血清水平、细胞水平、分子蛋白水平探索IL-35在MG中的作用。方法:第一部分:入组急性期MG患者41例,35名年龄性别相匹配的健康对照(Health control,HC)。采集患者的一般临床资料、应用美国重症肌无力基金会(Myasthenia Gravis Foundation of America,MGFA)的分期标准明确治疗后临床状态,并应用MG定量评分(Quantitative MG score,QMG)量表和MG日常生活(MG activities of daily living,MG-ADL)量表评分评估患者的临床症状,通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测MG患者外周血IL-35的水平;流式细胞仪检测MG患者T、B细胞亚群的变化;对其中24例治疗后轻微症状(Mimal Manifestation,MM)-3期的MG患者,通过ELISA和流式细胞仪的方法比较治疗前后MG患者外周血IL-35的表达水平及T、B细胞亚群的变化,从而明确IL-35在MG中表达情况及哪些T、B细胞亚群的失衡参与了MG的病情发展及转归。第二部分:对入组的41例MG患者及35名HC,流式细胞仪分析分泌IL-35的T、B细胞的比例,并比较MG不同亚型间分泌IL-35的T、B细胞的比例情况。随机选取8例未经治疗的MG患者及8名年龄性别匹配的HC,流式细胞仪分选出CD4+T细胞,给予MG组IL-35干预,通过PCR及流式细胞仪检测其是否可正反馈作用于分泌IL-35的T细胞。第三部分:对入组的MG患者中随机选出6例未经治疗的MG患者,流式细胞仪分选出CD4+T细胞进行体外培养,将其分为3组,分别为未干预组,促进Th17细胞分化组,促分化+IL-35干预组,通过PCR及流式细胞仪的方法观察IL-35对Th17细胞分化的影响,并通过Western blot明确IL-35在MG中作用的信号通路,从而明确MG患者中IL-35对Th17细胞的影响及可能的机制。结果第一部分:1.未经治疗的MG患者外周血中IL-35的水平(1.94±1.78ng/m L)低于HC(4.53±3.35ng/m L)(p=0.040);其中全身型MG(Generalized MG,GMG)患者外周血IL-35的水平(1.04±1.15ng/m L)低于眼肌型MG(Ocular MG,OMG)(2.75±2.38ng/m L)(p=0.002);合并胸腺瘤的MG患者(0.61±0.41ng/m L)低于未合并者(2.11±2.01ng/m L)(p=0.023)。2.24例治疗后MM-3期的MG患者外周血IL-35水平(5.17±2.71ng/m L)较治疗前升高(1.19±1.09ng/m L)(p0.001)。3.未经治疗的MG患者CD19+IL-10+B细胞的比例低于HC(p=0.008);24例治疗后MM-3期的MG患者CD19+IL-10+B细胞的比例较治疗前升高(p0.001)。4.未经治疗的MG患者CD4+CD25+T的比例低于HC(p0.001);未经治疗的MG患者Th1和Th17细胞的比例高于HC(p=0.039;p0.001);24例治疗后MM-3期的MG患者CD4+CD25+T细胞比例较治疗前升高(p=0.013),而Th17细胞比例较治疗前降低(p=0.006)。5.MG患者血清IL-35水平与临床特征进行相关性分析显示:MG患者血清IL-35水平与QMG及MG-ADL评分成负相关(r=0.002,p=-0.465;r=-0.361,p=0.020)。IL-35水平与Th17细胞比例成负相关(r=-0.335,p=0.031),与CD19+IL-10+B细胞比例成正相关(r=0.372,p=0.017)。6.MG患者血清IL-17的水平(77.28±27.1 pg/m L)高于HC(42.57±13.49 pg/m L)(p0.001),且GMG患者血清IL-17水平(90.51±25.7 pg/m L)高于OMG患者(58.61±16.10 pg/m L)(p0.001),合并胸腺瘤者(100.48±22.54 pg/m L)高于未合并者(71.66±25.33 pg/m L)(p=0.005),治疗后MM-3期的MG患者血清IL-17的水平较治疗前降低(p=0.002)。且MG患者血清IL-35与IL-17成明显的负相关(r=-0.514,p=0.001)。第二部分:1.未经治疗的MG患者中CD4+CD25+IL-35+的细胞比例低于HC(p0.001);且GMG低于OMG(p=0.003);合并胸腺瘤的比例低于未合并者(p=0.001);治疗后MM-3期者比例较治疗前升高(p0.001)。2.未经治疗的MG患者中CD19+IL-35+的细胞比例低于HC(p0.001)。其中GMG患者中CD19+IL-35+的细胞百分比低于OMG(p=0.001);合并胸腺瘤的比例低于未合并者(p=0.008);且治疗后MM-3期MG患者较治疗前升高(p=0.001)。3.IL-35干预后MG中EBI3和P35 m RNA的表达水平比未干预组及HC组高(p0.001,p0.001,p0.001,p0.001)。IL-35干预后MG中CD4+CD25+IL-35+T细胞的百分比较未干预组及HC组升高(p0.001,p=0.004)。第三部分:1.促分化组IL-17A及RORγt m RNA表达水平高于未干预组及IL-35干预组(p0.001,p=0.004,p0.001,p0.001)。IL-35干预组与未干预组之间的IL-17A及RORγt m RNA表达水平无明显差异(p=0.096,p=0.392)。2.促分化组CD4+IL-17A+T细胞的百分比高于未干预组及IL-35干预组(p0.001,p=0.001)。IL-35干预组与未干预组之间的CD4+IL-17A+T细胞的百分比之间无明显差异(p=0.284)。3.在MG中IL-35可能通过激活STAT1的信号通路来抑制Th17细胞的分化,发挥免疫抑制作用。结论1.T、B细胞亚群的失衡在MG的病情发展及转归中发挥重要作用,尤其是T细胞亚群。IL-35可能在MG的病情转归中发挥重要作用;IL-35急性期的降低可能与Treg和Breg细胞比例的降低有关。MG中IL-35可能通过调控Th17细胞来发挥免疫抑制作用。2.MG急性期分泌IL-35的T、B细胞的变化与细胞因子IL-35的变化一致,提示分泌IL-35的T、B细胞的失衡参与了MG病情的发展变化。IL-35可以通过正反馈作用于CD4+T细胞从而进一步促进IL-35的释放而发挥免疫抑制功能。3.MG患者中IL-35可以抑制Th17细胞的分化,此过程可能是通过激活STAT1的信号通路实现的。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R746.1
【文章目录】：中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明Ⅹ
前言
研究现状、成果
研究目的、方法
一、外周血IL-35水平与MG不同疾病状态及临床特征的相关性
1.1 对象和方法
1.1.1 研究对象
1.1.2 研究方法
1.1.3 统计分析
1.2 结果
1.2.1 MG患者及HCs人口学、特征分析
1.2.2 未经治疗的MG患者外周血IL-35的水平与HC的比较
1.2.3 治疗后MG患者外周血IL-35的水平与治疗前的比较
1.2.4 未经治疗的MG患者B细胞亚型与HC的比较
1.2.5 治疗前后MG患者B细胞亚型的变化
1.2.6 未经治疗MG患者T细胞亚型与HC的比较
1.2.7 治疗前后MG患者T细胞亚型的变化
1.2.8 MG患者血清IL-35与临床资料及T、B细胞亚型的相关性
1.2.9 MG患者血清IL-35与IL-17的相关性
1.3 讨论
1.4 小结
二、T、B细胞IL-35表达水平与MG不同疾病状态的相关性
2.1 对象和方法
2.1.1 研究对象
2.1.2 研究方法
2.1.3 统计分析
2.2 结果
2.2.1 未经治疗的MG患者与HC分泌IL-35的T细胞的比较
2.2.2 治疗前后MG患者分泌IL-35的T细胞的比较
2.2.3 未经治疗的MG患者与HC分泌IL-35的B细胞的比较
2.2.4 治疗前后MG患者分泌IL-35的B细胞的比较
2.2.5IL-35能正反馈作用于T细胞进一步分泌IL-35
2.3 讨论
2.4 小结
三、IL-35对Th17细胞分化的影响
3.1 对象和方法
3.1.1 研究对象
3.1.2 研究方法
3.1.3 统计分析
3.2 结果
3.2.1 三组间IL-17AmRNA的表达情况
3.2.2 三组间Th17细胞的比例情况
3.2.3 Westernblot实验结果
3.3 讨论
3.4 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
附录
综述 白细胞介素12家族细胞因子在神经系统自身免疫性疾病中的作用
综述参考文献
致谢
个人简历
【相似文献】
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本文编号：
2839363
