Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用

发布时间：2020-10-14 21:36

　　 研究背景神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是一种严重的神经系统的先天性缺陷,由于胚胎时期神经管发育过程中闭合异常引起,主要表现各种脑畸形。神经上皮细胞即神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是神经管闭合的关键细胞,覆盖在神经管表面,其增殖、分化及迁移是神经管正常闭合的关键,其异常的增值分化会导致神经管缺陷,它具有自我更新能力及分化成多种细胞的能力,可分化为各种神经细胞。在各种调节通路中,Notch信号通路对细胞的增殖分化及胚胎发育起着精密而复杂的调控作用,Notchl是Notch蛋白家族中的重要分子,在中枢神经系统的发育中起着关键作用,Notchl信号通路依靠γ内分泌酶的作用被激活。全反式维甲酸(All-trans Retinoic Acid,ATRA)在体内是维A酸的正常代谢产物,是胚胎发育的重要因素,而研究发现过量全反式维甲酸导致NTDs的发生,但其具体的分子机制未研究清楚。本研究,从细胞学水平研究Notchl在全反式维甲酸处理过的NSCs中的作用,探讨Notchl对NSCs增殖分化的调节作用,揭示全反式维甲酸导致神经管缺陷的分子机制,从而为神经干细胞的应用及临床预防神经管缺陷提供新的方向。目的通过利用ATRA处理神经干细胞,检测神经干细胞分化产生的细胞标记物及Notchl的表达,研究Notchl及ATRA与神经干细胞分化的作用,探究Notchl在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用,从而揭示其对神经管发育的影响。方法1.原代神经干细胞的提取将C57/BL6小鼠按照雌雄2:1的比例(雌鼠2只,雄鼠1只)合笼,第二天早8点检查雌鼠有无阴栓,见栓后记为孕0.5天,取孕18.5胎鼠的大脑提取原代神经干细胞。2.免疫荧光用含有10%的胎牛血清的分化培养基对神经干细胞进行诱导分化,然后免疫荧光鉴定神经干细胞及分化产生的神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞,并检测Notch1在上述细胞的中的分布。3.Western blotting3.1 Western blotting检测神经干细胞中Notch1,神经干细胞标记物-巢蛋白(Nestin)、神经元标记物-神经丝蛋白(NF)、星型胶质细胞标记物-神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞标记物-半乳糖脑苷脂(GALC)分别在普通分化培养基(对照组)和1 μ mol/LATRA(实验组)中1,3,5,7天时的含量。3.2将神经干细胞分为四组:A组:普通分化培养基,B组:普通分化培养基+DMSO组,C组:普通分化培养基+DMSO+25μMol γ-内分泌酶抑制剂,D组:普通分化培养基+DMSO+50μMol γ-内分泌酶抑制剂,然后用Western blotting技术分别检测各组Notch1含量。结果1.原代神经干细胞分化培养1天时,可见多个神经球形成。分化3天时,神经球形态开始发生改变,部分神经干细胞从神经球中游离出来。分化5天时,神经球明显减小,伸出条索状突起。分化7天时,可见多种不同形态的神经细胞,一种是胞体成圆形或椭圆形,伸出一条细长突起的神经元样细胞,一种是胞体成多角型并伸出多条较粗的突起,可见明显胞核的星型胶质样细胞,一种是胞体较小,伸出短小突起的少突胶质样细胞。2.免疫荧光鉴定分化培养基中神经干细胞中Nestin、NF、GFAP及GALC成阳性,且在神经干细胞、神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞胞膜上及细胞质中有Notch1存在。3.ATRA处理神经干细胞前后Notch1及NF、GFAP、GALC的含量变化从1天到5天,对照组的神经干细胞中Notch1,第5天相对第1天有明显的增加(P＜0.05),从第5天到第7天,Notch1明显下降(P＜0.05),NF在第3天相对第1天有明显增加(P＜0.05),第5相对第3天有明显下降(P＜0.05),GFAP与GALC含量在1,3天无明显变化,GFAP第5天明显相对第1天明显下降(P＜0.05),而第7天含量相比第5天明显增加(P＜0.05)。GALC第5天明显相对第1天明显下降,而第7天含量相比第5天明显增加(P＜0.05)。实验组的神经干细胞,1天到3天时,Notch1未见明显变化,第7天Notch1含量较第1天明显下降(P＜0.05),而NF第7天含量相比第1天明显增加(P＜0.05),第5天与第1天相比明显增加(P＜0.05),GFAP第7天含量相比第1天明显增加(P＜0.05),第5天与第1天相比明显增加(P＜0.05),GALC第7天含量相比第1天明显增加(P＜0.05),第5天与第1天相比明显增加(P＜0.05)。4.γ内分泌酶抑制剂处理神经干细胞后Notch1含量变化C组的神经干细胞Notch1的胞内段(分子量120KD)表达量较A组明显降低(P＜0.05),D组的神经干细胞Notch1的胞内段(分子量120KD)表达量较A组明显降低(P＜0.05),C组的神经干细胞Notch1的全长(分子量300KD)表达量较A组明显增加(P＜0.05),D组的神经干细胞Notch1的胞内段(分子量300KD)表达量较A组明显(P＜0.05)。结论1.Notch1抑制神经干细胞分化。2.ATRA处理神经干细胞后,Notch1含量下降,神经干细胞分化增强,ATRA促进神经干细胞的分化。3.γ内分泌酶抑制剂作用于神经干细胞,NICD含量减少,抑制神经干细胞分化的能力下降。我们推测ATRA主要通过抑制γ内分泌酶的作用而抑制Notch1信号通路,从而促进神经干细胞的分化。为我们对神经干细胞在将来的临床应用提供了理论基础并且给我们预防胎儿神经管缺陷提供了新的治疗窗口。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R741
【部分图文】：

图２神经干细胞分化产生的细胞（倒置显微镜，Ｘ４０）??Ａ．神经元样细胞，胞体成圆形或椭圆形，伸出一条细长突起．Ｂ．星型胶质样胞，胞体成多角型并伸出多条较粗的突起，可见明显胞核．Ｃ．少突胶质样细胞，体较小，伸出短小突起。??图３神经干细胞分化产生的细胞（荧光显微镜，Ｘ２００）??

?山东大学硕士学位论文???Ａ．神经元细胞（红色，ＮＦ）?Ｂ．星型胶质细胞（红色，ＧＦＡＰ）?Ｃ．少突胶质细??胞（红色ＧＡＬＣ）??Ａ．Ｎｏｔｃｈｌ?＋?Ｎｅｓｔｉｎ?Ｂ．Ｎｏｔｃｈｌ?＋?ＮＦ?Ｃ．Ｎｏｔｃｈｌ?＋?ＧＦＡＰ?Ｄ．Ｎｏｔｃｈｌ＋ＧＡＬＣ??

图６?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测经ＡＴＲＡ处理的神经干细胞在１，３，５，７天时Ｎｏｔｃｈ?１、??ＮＦＦＡＰ、ＧＡＬＣ?的含量??图Ａ，?Ｎｏｔｃｈｌ在１天到３天时，未见明显变化，第７天含量较第１天明显下??降（尸＜０．０００１），??图Ｂ．?ＮＦ第７天含量相比第１天明显增加（Ｐ０．０００１），第５天与第１天相比明显??增力ｎ（Ｐ＜０．０００１），图Ｃ．?ＧＦＡＰ第７天含量相比第１天明显增加（Ｐ＜０．０００１），第５??天与第１天相比明显增加（ｐ＝〇．〇〇〇ｌ?），图Ｄ．ＧＡＬＣ第７天含量相比第１天明显增??加（Ｐ＝０．０００１），第５天与第１天相比明显增加（ＺＭＸ０００７）。??Ｎ〇ｔｃｈｉ（３〇〇ｋｄ）?????．?＇＊１＾．１?ｒｎ＇ｗｍ■…??Ｎ〇ｔｃｈｉ（ｉ？〇ｋｄ）??Ｔｕｔ＞ｕ＂ｎ?￣一??ｒｓｉｖ＞ｕ．Ｍ（?１?＾ＯＫｉｉ）?ＨＭ?２?Ｉ?￣￣￣￣?Ｉ??ｒｓｉ〇ｉｔ?ｉ“３〇（》ｋ？ｉ》■?ｉ?｜?■?—?—?＊?｜??
【参考文献】

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本文编号：2841225