LSD1促进β-catenin在神经母细胞瘤胞质中堆积
发布时间：2020-10-25 05:45
目的本研究旨在证实在神经母细胞瘤(neuroblastoma NB)细胞中LSD1促进β-catenin在胞质中堆积,证实LSD1通过激活Wnt通路,从而引起NB细胞的增殖和转移,并为进一步探索其分子机制提供理论及实验支持。方法Western Blot方法分别检测LSD1在NB细胞株SH-SY5Y细胞、人上皮细胞、大鼠海马神经元细胞中的表达。将NB细胞株SH-SY5Y细胞分为三组:A组为LSD1过表达组,转染LSD1慢病毒载体组,SH-SY5Y细胞内LSD1表达上调;B组对照组为转染空载质粒,SH-SY5Y细胞中的LSD1与β-catenin的表达量未受到干扰;C为LSD1干扰组,本组SH-SY5Y细胞内的LSD1活性被反苯环丙胺抑制剂(TCP)抑制。利用Quantitative real-time PCR(qPCR)方法分别检测三组细胞中LSD1的表达情况及慢病毒载体的转染效率。Western blot方法检测并三组细胞中LSD1及β-catenin的表达并分析二者的表达关系。免疫组织化学方法检测在SH-SY5Y细胞中调控LSD1表达后β-catenin的变化。结果人上皮细胞、大鼠神经元细胞、SH-SY5Y细胞中LSD1的表达有显著区别,人上皮细胞、大鼠神经元细胞、SH-SY5Y细胞三者Western Blot的灰度值分别为133.87±10.54;135.00±12.48;192.00±13.23,三组进行单因素方差分析无明显统计学意义(p0.05);建立lsd1稳转细胞株前后,SH-SY5Y细胞表达LSD1量有变化,通过qPCR对SH-SY5Y细胞株中的lsd1的相对量进行检测,A组、B组C组qPCR的阈值循环数分别为13.216±0.137、17.330±1.166、22.003±0.320三组进行单因素方差分析p﹤0.01,差异具有统计学意义;Western Blot结果显示,A组、B组、C组LSD1的灰度值为131.42±11.45、236.82±13.94、105.58±12.53,p﹤0.01,差异具有统计学意义;A组、B组、C组β-catenin的表达灰度值为137.82±10.99、218.53±13.22、118.58±12.66,p﹤0.01,差异具有统计学意义;调控LSD1表达后,SH-SY5Y细胞中β-catenin在胞质中的堆积量明显变化,LSD1表达上下调控后,β-catenin在胞质中的堆积量随之上下变化。(不同组间数据相关性检验r=0.99,p﹤0.01);免疫组化染色结果为A组免疫组化染色,胞质为棕色,表明β-catenin在胞质中大量堆积;B免疫组化染色,胞质为浅棕色,表明有一定量的β-catenin在胞质中堆积,但堆积量量不如LSD1高表达组明显;C组胞质不着色,表明β-catenin在胞质中的堆积量较少。结论在NB细胞株SH-SY5Y细胞中,LSD1的表达上调,初步实验表明,在NB细胞中LSD1的表达水平较正常神经元细胞及上皮细胞要高;进一步推测其生物学活性,在NB细胞中β-catenin在胞质中的堆积量与LSD1表达量呈正相关。β-catenin蛋白是Wnt通路的关键因子,LSD1通过增加β-catenin在胞质中的堆积量进而激活Wnt通路从而影响NB细胞的生物学活性。意义本实验成功构建了lsd1稳转的NB细胞株,可供下一步实验继续使用。证实了在NB细胞SH-SY5Y细胞株中,LSD1高表达,并且经过验证其生物学活性,得知在NB细胞SH-SY5Y细胞株中β-catenin在胞质中的堆积量与LSD1的表达的呈正相关。推测出LSD1通过上调β-catenin在细胞中的表达进一步影响NB的生物学活性。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：
结果结果1 不同细胞中 LSD1 的表达情况利用 Western Blot 方法检测人上皮细胞、大鼠神经元细胞、SH-SY5Y 细胞中 L的表达量，人上皮细胞、大鼠神经元细胞、SH-SY5Y 细胞三者 Western Blot 的值分别为 133.87±10.54;135.00±12.48;192.00±13.32,三组进行单因素方差分析，无明显统计学意义（p>0.05）；人上皮细胞、SH-SY5Y 细胞中 LSD1 的表达，两样本均数 t 检验，差异具有统计学意义（p<0.01）；大鼠神经元细胞、SH-S细胞两组间进行两样本均数 t 检验，差异具有统计学意义（p<0.01）。说明 NB 中 LSD1 的表达量高于人上皮细胞及大鼠神经元细胞。（见图 1）
图 2 起始拷贝数的对数Fig 2 The logarithm of the initial copy number3 调控 LSD1 表达后，SH-SY5Y 中 LSD1 表达量的变化在 SH-SY5Y 细胞系中，成功敲除 lsd1，通过 PCR 检测构建质粒和寡核苷酸链的有效性并转染 SH-SY5Y 细胞系；然后通过 Western Blot、免疫荧光、免疫组化等方法来确定,β-catenin 在胞质中的堆积量的变化。Western Blot 结果显示，处理后的 SH-SY5Y 细胞中 LSD1 的表达量，A 组、B 组、C 组分别为236.82 13.94、131.42 11.45、105.58 12.53，三组进行单因素方差分析差异有统计学意义(P=0.001，P<0.01)。（见图 3）
图 2 起始拷贝数的对数Fig 2 The logarithm of the initial copy number1 表达后，SH-SY5Y 中 LSD1 表达量的变化Y5Y 细胞系中，成功敲除 lsd1，通过 PCR 检测构建质粒性并转染 SH-SY5Y 细胞系；然后通过 Western Blot、免疫来确定,β-catenin 在胞质中的堆积量的变化。Western Blot SH-SY5Y 细胞中 LSD1 的表达量，A 组、B 组、C 组131.42 11.45、105.58 12.53，三组进行单因素方差分析差001，P<0.01)。（见图 3）
【参考文献】
本文编号：2855553
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：
结果结果1 不同细胞中 LSD1 的表达情况利用 Western Blot 方法检测人上皮细胞、大鼠神经元细胞、SH-SY5Y 细胞中 L的表达量，人上皮细胞、大鼠神经元细胞、SH-SY5Y 细胞三者 Western Blot 的值分别为 133.87±10.54;135.00±12.48;192.00±13.32,三组进行单因素方差分析，无明显统计学意义（p>0.05）；人上皮细胞、SH-SY5Y 细胞中 LSD1 的表达，两样本均数 t 检验，差异具有统计学意义（p<0.01）；大鼠神经元细胞、SH-S细胞两组间进行两样本均数 t 检验，差异具有统计学意义（p<0.01）。说明 NB 中 LSD1 的表达量高于人上皮细胞及大鼠神经元细胞。（见图 1）
图 2 起始拷贝数的对数Fig 2 The logarithm of the initial copy number3 调控 LSD1 表达后，SH-SY5Y 中 LSD1 表达量的变化在 SH-SY5Y 细胞系中，成功敲除 lsd1，通过 PCR 检测构建质粒和寡核苷酸链的有效性并转染 SH-SY5Y 细胞系；然后通过 Western Blot、免疫荧光、免疫组化等方法来确定,β-catenin 在胞质中的堆积量的变化。Western Blot 结果显示，处理后的 SH-SY5Y 细胞中 LSD1 的表达量，A 组、B 组、C 组分别为236.82 13.94、131.42 11.45、105.58 12.53，三组进行单因素方差分析差异有统计学意义(P=0.001，P<0.01)。（见图 3）
图 2 起始拷贝数的对数Fig 2 The logarithm of the initial copy number1 表达后，SH-SY5Y 中 LSD1 表达量的变化Y5Y 细胞系中，成功敲除 lsd1，通过 PCR 检测构建质粒性并转染 SH-SY5Y 细胞系；然后通过 Western Blot、免疫来确定,β-catenin 在胞质中的堆积量的变化。Western Blot SH-SY5Y 细胞中 LSD1 的表达量，A 组、B 组、C 组131.42 11.45、105.58 12.53，三组进行单因素方差分析差001，P<0.01)。（见图 3）
【参考文献】
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2 鹿洪亭;董蒨;高强;郝希伟;宋华;赵楠;;神经母细胞瘤细胞系裸鼠转移模型及局部皮下荷瘤模型的建立[J];中华肿瘤杂志;2010年04期
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1 雷增杰;组蛋白去甲基化酶LSD1促进肿瘤细胞“干性”和侵袭转移的机制研究[D];第三军医大学;2015年
本文编号：2855553
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