大鼠的神经病理性疼痛与整体水平的蛋白质发生亚硝基化程度的关系

发布时间：2020-10-27 01:02

　　 目的1、建立神经病理性疼痛(SNI)大鼠模型,为研究导致其发生的物理及化学性因素提供一个良好的基础。2、研究产生神经病理性疼痛的相应区域的蛋白质在整体水平上发生的巯基亚硝基化的程度变化。3、正常SD大鼠鞘内给与不同浓度的NO供体或前体,观察大鼠行为学变化及蛋白亚硝基化水平的变化。4、使用可以逆转已发生的蛋白质巯基亚硝基化的试剂,是否可以显著减轻神经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏反应。方法1、选用体重300-350g的雄性SD大鼠,制备SNI动物模型,即结扎后离断大鼠右侧坐骨神经的分支腓总神经和胫神经,保留腓肠神经,避免牵拉或损伤,对照组即假手术组,暴露神经后保护所有神经及分支不受牵拉或损伤,其余同手术SNI组,观察大鼠有疼痛行为后,于术后每天进行应用动态足底触觉计对各组大鼠的右足机械痛程度进行量化并进行比较,50%缩足反应阈值(PWT)=10log(x)+kδ,PWT小于4g作为出现机械痛敏的标准,建模失败者将排除实验之外,Western blot检测全部蛋白质的亚硝基化水平。2、选用体重300-350g的雄性SD大鼠鞘内置管:即蛛网膜下腔置管。大鼠麻醉后,采用旁侧入路。平行于两侧髂棘连线中点到尾椎起点的连线,旁开0.5cm,导管头端进入蛛网膜下腔约2cm,将导管一端固定于筋膜层,另一端引至大鼠后颈部固定在皮肤上,热凝封闭备用。清醒后选择无后肢运动异常的大鼠,经导管给予局麻药2%利多卡因10μl,如出现后肢瘫痪证明鞘内置管成功,恢复一周后用于实验。3、选用体重300-350g的雄性SD大鼠,取36只大鼠制备SNI动物模型,观察大鼠有疼痛行为后(保留6只正常大鼠),随机分为6组,每组6只,建立各实验组:N组(正常组);S组(假手术组):大鼠右下肢神经不做结扎及切断;SNI组,又将其按天数分为D1组;D4组;D7组;D14组。于第1,4,7,14天各组处死6只,取脊髓组织腰膨大处。4、选用体重300-350g的雄性SD大鼠,鞘内置管,恢复7天后用于实验。取24只大鼠根据鞘内给与不同浓度的NO供体GSNO随机分为4组,每组6只,建立各实验组:O对照组(DMSO 10μl)、A组(GSNO 10μg/10μl)、B组(GSNO30μg/10μl),C组(GSNO 90μg/10μl)。上述药物每日均进行鞘内注射。于连续给药后第7天,处死各组大鼠,取脊髓组织腰膨大处。5、选用体重300-350g的雄性SD大鼠,鞘内置管,恢复7天后用于实验。取18只大鼠制备SNI动物模型,观察大鼠有疼痛行为后,随机分为3组,每组6只,建立各实验组。O组(对照组):鞘内给与100%DMSO 10μl;NEM组:鞘内给与NEM 100μg/10μl,亚硝基化阻断剂;ODQ组:鞘内给与ODQ30μg/10μl,PKG通路阻断剂。上述药物每日均进行鞘内注射。于连续给药后第7天,处死大鼠,取脊髓组织腰膨大处。6、用应用动态足底触觉计每日对各组大鼠的机械痛程度进行量化并进行比较,Western blot检测全部蛋白质的亚硝基化水平。7、脊髓背角总蛋白的检测:遮光条件下,取大鼠L4-L6(腰膨大)的脊髓裂解、离心取上清。用生物素转化法使发生亚硝基化的蛋白质生物素化,利用链霉亲和琼脂糖(streptavidin-agarose)将生物素化的蛋白质从裂解液中提取出来,制备样本。结果1、SNI模型SD大鼠术后术侧足轻度外翻并有自发性疼痛和痛觉过敏的表现,SNI模型SD大鼠于术后第4天开始产生明显的疼痛,术侧足的50%缩足阈值明显下降,P0.05代表差异有统计学意义,由此明确神经病理性疼痛模型建模成功。手术后第7天50%缩足阈值下降到峰值,持续至术后28天。2、SD大鼠鞘内给与不同浓度的NO供体GSNO,各组大鼠50%缩足阈值在GSNO 30μg/10μl浓度时开始增高,整体水平上的蛋白质亚硝基化水平降低趋势明显,有显著统计学意义(P0.001)。3、SNI模型SD大鼠鞘内置管分别给与有DMSO、阻断剂NEM和ODQ,各组大鼠机械痛阈值和全部蛋白质发生亚硝基化的水平比较:使用阻断剂NEM的大鼠机械疼痛值明显增高,全蛋白发生亚硝基化明显降低,有统计学意义(P0.001);使用阻断剂ODQ的PKG通路蛋白含量亦有降低,有统计学意义(P0.05)。结论1、整体水平上的蛋白质发生亚硝基化的程度与神经病理性疼痛的具有正相关性。2、从一定浓度开始,NO即可以使蛋白质发生亚硝基化。3、亚硝基化阻断剂NEM及PKG通路阻断剂ODQ对神经病理性疼痛均有治疗作用,NEM作用比较明显。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R741
【部分图文】：

162、整体水平蛋白质巯基亚硝基化的提纯与检测：图1 蛋白质巯基发生亚硝基化的提纯过程（1）每个样品取出 15μl，加 HENS Buffer 稀释到 60μl，各加 2μl MMTS 均匀混合 1min，避光室温下孵育 30min，封闭游离的半胱氨酸硫醇。（2）在-20℃下，加入 600μl 的预冷丙酮进行沉淀，去除 MMTS，沉淀至少1 小时。（3）4℃离心机进行样品离心 1000g×10min

结 果、SD 大鼠 SNI 模型术后情况术后大鼠伤口无感染，多数逐渐愈合，少数大鼠术后 2 天开始出现由于疼咬伤口，开线化脓等情况，则重新消毒，进行缝合；鞘内置管的 SD 大鼠有出现脱管，穿刺部位水肿，偏瘫，自噬等情况，为建模不成立。其他大鼠术 天基本活动能力与正常大鼠无差别。但 SNI 组大鼠术侧足在形状、步态和姿与 O 组大鼠相比有差异，而 S 组大鼠与 O 组大鼠相比，其动情况、行走步姿势均无明显改变。如图，SNI 组大鼠术后 3 天可见右侧足形态异常，表现为足轻度外翻，运以左足为主，右足轻落在地上或不敢着地，刺激后出现缩足或舔足动作。

图 3-1 三组大鼠 50%缩足阈值比较曲线图：成年 SD 大鼠分为三组，SNI 模型组，S 组为假手术组，N 组为正常组。通过 von用 Up and Down 方法测定术后 50%缩足阈值。***P＜0.001vs S 组；**P<0.05vs S 组###P<0.0001vs N 组。3-2 Western Blot 检测 SNI 模型大鼠不同天数全蛋白亚硝基化变化水平
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 汪达丽;张双双;刘建中;;蛋白质亚硝基化检测和鉴定方法的研究进展[J];植物生理学报;2014年08期

2 陈畅;黄波;韩佩韦;段绍瑾;;蛋白质巯基亚硝基化——一种典型氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰[J];生物化学与生物物理进展;2006年07期

本文编号：2857783