胶质母细胞瘤中EGFR-CSN6通路调节PD-L1表达的研究

发布时间：2020-10-27 01:32

　　 目的:研究报道CSN(COP9 signalosome)信号小体家族中的CSN6在胶质母细胞瘤中过表达与肿瘤进展密切相关,同时有临床数据证明抑制PD-1/PD-L1免疫治疗策略可能为胶质母细胞瘤的治疗提供新的思路。CSN信号小体可能与肿瘤相关蛋白的泛素化调节相关,有研究证实CSN家族成员可以使PD-L1蛋白稳定性增加引起乳腺癌的免疫逃逸。但是CSN6是否通过影响PD-L1蛋白的稳定性,进而调控胶质母细胞瘤中PD-L1表达还不清楚。因此,本研究采用人胶质瘤标本以及体外培养胶质母细胞瘤肿瘤细胞,探讨EGFR-ERK通路是否通过调控CSN6表达,进而介导胶质母细胞瘤中PD-L1蛋白的表达,旨在为胶质母细胞瘤的相关免疫靶向治疗提供新的思路与研究方向。方法:1.收集人胶质瘤标本,采用免疫组织化学法和免疫荧光检测EGFR、CSN6和PD-L1共表达情况;分析其与临床病理学特征和预后的相关性。2.培养人胶质母细胞瘤细胞U87和U251,体外给予EGF激活细胞EGFR-ERK通路,给予ERK阻断剂或siRNA转染技术抑制CSN6表达,在细胞水平验证激活EGFR-ERK通路调控CSN6对PD-L1转录后蛋白表达的影响。结果:1.不同级别人类胶质瘤组织标本中EGFR,CSN6和PD-L1表达与预后相关性TCGA库中人类胶质瘤组织标本中mRNA水平上EGFR在胶质母细胞瘤中表达水平最高(P0.0001),与病人不良预后具有相关性(P0.05)。CSN6在胶质母细胞瘤中表达水平高于星形胶质瘤,星形胶质瘤中的表达水平高于正常脑组织(P0.0001),与病人不良预后具有相关性(P0.05)。PD-L1在胶质母细胞瘤中表达水平高于星形胶质瘤(P0.05),与病人不良预后具有相关性(P0.05)。本研究选取的标本分析结果提示人胶质母细胞瘤组织标本中EGFR蛋白表达高于星形胶质瘤IHC评分[Astrocytoma:1(0,4)vs glioblastoma:4(2,9)](P0.0001),星形胶质瘤病人标本中EGFR蛋白高于正常脑组织,IHC评分[Normal brain:0(0,0)vs astrocytoma:1(0,4)](P=0.0002);胶质母细胞瘤与间变星形胶质瘤中EGFR蛋白表达没有统计学差异IHC评分[Anaplastic astrocytoma:6(3,12)vs glioblastoma:4(2,9)](P=0.1344)。EGFR蛋白高表达与病人不良预后具有正相关性(P0.0001)。人胶质母细胞瘤组织标本中CSN6蛋白的表达高于星形胶质瘤,IHC评分[Astrocytoma:0(0,2)vs glioblastoma:4(1,6)](P0.0001),星形胶质瘤病人标本中CSN6蛋白与正常脑组织表达没有统计学差异,IHC评分[Normal brain:0(0,1)vs astrocytoma:0(0,2)](P=0.0969);CSN6蛋白在胶质母细胞瘤中表达情况高于间变星形胶质瘤,IHC评分[Anaplastic astrocytoma:4(2,8)vs glioblastoma:4(1,6)](P=0.0388)。CSN6蛋白高表达与病人不良预后具有正相关性(P0.0001)。人胶质母细胞瘤组织标本中PD-L1蛋白表达高于星形胶质瘤,IHC评分[Astrocytoma:1(0,2)vs glioblastoma:4(1,9)](P=0.0002),星形胶质瘤病人标本中PD-L1蛋白高于正常脑组织,IHC评分[Normal brain:0(0,0.25)vs astrocytoma:1(0,2)](P=0.0036);胶质母细胞瘤与间变星形胶质瘤中PD-L1蛋白表达没有统计学差异,IHC评分[Anaplastic astrocytoma:4(2,9)vs glioblastoma:4(1,9)](P=0.2226)。PD-L1蛋白高表达与病人不良预后具有正相关性(P=0.0019)。2.人类胶质瘤组织标本中EGFR,CSN6和PD-L1表达相关性免疫荧光结果显示:EGFR和CSN6;CSN6和PD-L1蛋白在胶质瘤细胞中可以共表达;免疫组织化学结果分析EGFR、CSN6和PD-L1蛋白在胶质瘤组织中表达具有正相关性。3.胶质母细胞瘤PD-L1表达与肿瘤微环境中CD8~+T细胞浸润相关性。PD-L1蛋白表达与肿瘤微环境中CD8~+T细胞浸润呈负向相关性,其中PD-L1~(Low)CD8~+T~(More)的病人预后最好,PD-L1蛋白表达和CD8~+T浸润联合检测,对病人预后判断具有重要意义。4.EGFR-ERK信号通路调控CSN6对胶质母细胞瘤PD-L1表达的影响。体外给予EGF刺激激活EGFR-ERK通路,上调CSN6和PD-L1表达;阻断ERK通路,抑制CSN6和PD-L1表达。通过siRNA技术敲低CSN6蛋白后,EGFR-ERK通路无法上调PD-L1蛋白。半衰期实验发现抑制EGFR-ERK通路促进新蛋白合成后,EGF仍然能够维持PD-L1蛋白的表达水平,进而提示激活CSN6延长PD-L1蛋白半衰期,PD-L1蛋白的稳定性增加。结论:1.人类胶质瘤组织标本中EGFR、CSN6和PD-L1蛋白表达具有正相关性,与病人不良预后密切相关。PD-L1蛋白表达与肿瘤微环境中CD8~+T细胞浸润呈负向相关性,其中PD-L1~(Low)CD8~+T~(More)的病人预后最好,PD-L1蛋白表达和CD8~+T浸润联合检测,对病人预后判断具有重要意义。2.体外实验中,EGFR-ERK信号通路激活可以上调胶质母细胞瘤中CSN6表达,进而调控PD-L1蛋白表达稳定性。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

25图2胶质瘤中EGFR, CSN6和PD-L1蛋白表达的相关性Fig.2 Correlation between EGFR, CSN6 and PD-L1 expression in humanglioma tissues.Immunofluorescence staining indicated that EGFR and CSN6 or CSN6and PD-L1 proteins could co-express in glioma tissues (A). Representative

图 3 PD-L1 在人脑胶质母细胞瘤组织样本中的表达情况及其与 CD8+TILs浸润密度的关系和临床预后的关系Fig.3 The correlation between PD-L1 expression and CD8+T cell infiltrationnumber in tumor microenvironment.Representative images of higher level PD-L1 expression and low CD8+Tcell infiltration in different cases of glioblastoma samples are shown (A).Representative images of lower level PD-L1 expression and high CD8+T cellinfiltration in different cases of glioblastoma samples are shown (B). CD8+Tcell infiltration was shown in low and high level PD-L1 GBM samples (C).PD-L1 protein expression was significantly negatively correlated with CD8+Tcell infiltration in tumor microenvironment (D). The combination of PD-L1protein expression and CD8+T infiltration was related with patient survival inhuman GBM (E,F,G).

图 4 EGFR-ERK 信号通路激活上调 CSN6 和 PD-L1 蛋白的表达Fig.4 CSN6, activated by EGFR-ERK pathway, regulate PD-L1 proteinexpression in vitroKnockdown of CSN6 protein by siRNA inhibited PD-L1 upregulationon the EGFR-ERK pathway. After inhibiting the synthesis of new protein the half-life experiment, EGF still maintained the existence of PD-L1tein, which suggests that CSN6 by EGFR-ERK pathway increase thebility of PD-L1 protein in GBM. U87 (A) and U251 (B) cells were treatedth EGF(200ng/ml) for 2, 4, 6, 8, 10h. U87 (C) and U251 (D) cells wereated with different doses of EGF for 5 h. U87 (E) and U251 (F) cells wereated with or without PD98059 (20 μM) for 1 h and then treated with EGF0 ng/ml) for 5h. The expression of CSN6、EGFR、p-ERK and PD-L1 wasasured by Western blot(*P＜0.05,*vs Contral).
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本文编号：2857820