基于蛋白质组学方法研究自噬基因PINK1和WDR45突变诱发的神经退行性病变机制

发布时间：2020-11-01 08:52

　　 细胞自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程,主要功能是清除胞内聚集的蛋白质和受损的细胞器,并回收部分小分子如氨基酸和脂肪酸等为合成代谢提供基础。自噬功能异常会导致胞内代谢紊乱进而诱发一系列疾病。神经细胞是种高度分化的细胞,随着年龄的增长和活性氧等应激的增加,胞内容易累积异常聚集的蛋白,若因自噬功能受损不能及时清除这些聚集的蛋白,会导致神经元死亡,进一步诱发神经退行性病变。目前关于自噬和神经退行性病变研究的热点主要集中在阐述自噬的起始,底物的隔离以及溶酶体的降解机制等,关于自噬如何调控神经元的凋亡机制尚未完全研究清楚。基于液相色谱-高分辨质谱联用(LC-MS/MS)的定量蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学技术能够大规模鉴定和定量蛋白质水平及磷酸化位点的变化,有助于系统地理解如细胞周期、受体信号传导、DNA损伤与修复、神经突触的信号传递与重塑等基本生命现象。本研究以两种自噬基因突变小鼠模型为出发点,全面解析其神经元的蛋白质组学或磷酸化蛋白质组学图谱,期望阐明自噬缺失导致神经元凋亡的机制。PINK1激酶失活突变是常染色体隐性遗传的早发性帕金森病(Parkinson’s disease,PD)最常见的一种致病突变。近期研究表明PINK1作为蛋白激酶磷酸化Parkin、泛素等分子介导线粒体自噬从而维持细胞稳态,然而线粒体自噬对神经元的存活和行使正常功能是否有直接影响尚未可知。我们从野生型和Pink1基因敲除小鼠脑组织中获取神经元进行体外培养,建立药物诱导线粒体膜电位去极化引发的线粒体损伤,在此基础上,利用磷酸化蛋白质组的技术大规模定量研究Pink1基因敲除后对原代神经元磷酸化蛋白质组的影响。通过生物信息学分析发现Pink1调控的通路主要包括mTOR信号通路,神经营养因子信号通路以及胰岛素信号通路。进一步在体内外验证了Pink1可以直接磷酸化促凋亡蛋白BAD(Bcl2 antagonist of cell death)的S112(第112位丝氨酸)位点并抑制其促凋亡活性。在Pink1基因敲除神经元中过表达BAD的模拟磷酸化蛋白(第112位丝氨酸S突变成天冬氨酸D)可以回复线粒体损伤导致的细胞凋亡。综上所述,我们的研究揭示了PINK1通过直接调控促凋亡蛋白BAD的活性控制神经元的凋亡。WDR45是螺旋桨蛋白相关的神经退行性变(BPAN,β-propeller Protein Associated Neurodegeneration)的致病基因。WDR45属于包含色氨酸-天冬氨酸40个氨基酸重复序列(WD40)的蛋白家族,目前的研究认为WDR45在AMPKULK1下游参与自噬调控,通过与ATG2相互作用促进自噬小体膜的延伸与形成。对WDR45在BPAN发病机制的理解仅限于明确了WDR45缺失导致细胞自噬水平发生异常,但自噬异常是否影响蛋白质质量控制系统并进一步导致神经退行性变尚不清楚。我们利用CRISPR/CAS9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein)技术获得全身性Wdr45基因敲除(Wdr45 KO)小鼠,行为学、电生理结果显示Wdr45 KO小鼠具有认知障碍与突触传递障碍,免疫组化结果显示16月龄KO小鼠前额皮质和黑质脑区神经元数量减少。通过定量蛋白质组学分析比较野生型和Wdr45 KO小鼠的多个脑区在发病早期蛋白质组的变化,发现大量内质网蛋白在KO小鼠显著积累。功能实验发现Wdr45缺失的细胞内质网面积增大,内质网应激增加,激活IRE1α或PERK通路,最终导致神经元凋亡。用自噬激活剂或内质网应激抑制剂可以回复KO细胞的凋亡。因此,我们初步揭示了WDR45通过维持内质网稳态调控神经元凋亡的机制。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R741
【部分图文】：

.1 细胞自噬细胞自噬定义最早由 Christian de Duve 于 1963 年提出：自噬是将胞内输至溶酶体或液泡中降解的过程[7]。自噬的底物包括可溶性因子如蛋白质复合体如核糖体以及细胞器等[8, 9]。从降解物运送至溶酶体的途径来看自巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的chaperone-mediatedautophagy,CMA）[10,11]。巨自噬是目前研究最多的 种自噬小体将待降解物包裹，与溶酶体融合后完成降解[12]。微自噬是溶酶体陷直接吞噬细胞内物质，并在溶酶体中降解[13]。分子伴侣介导的自噬是指ERQ 保守序列的可溶性蛋白被分子伴侣 Hsc70 复合体识别后运输至溶酶[14]。本课题研究对象为巨自噬，下文中涉及的自噬均为巨自噬。

1.1.2 自噬和神经退行性病变神经元维持胞内稳态依赖于自噬，这可以从大脑通常是原发性溶酶体疾病中受影响最严重的器官中得到证实。因为神经元具有异常大的树突状和轴突细胞质，图 2 哺乳动物细胞自噬过程[6]低能和饥饿诱导可以诱发自噬，具体机制是抑制 mTORC1 和活化 AMPK，其反过来通过 系列磷酸化正向调节 ULK1 复合物，ULK1 复合物随后激活 VSP34 复合物，导致前自噬体结构中的 PI3P 合成，PI3P 通过协助募集 ATG12-ATG5-ATG16L1 复合物来定义自噬体前体的 LC3 脂化位点并维持自噬小体膜的延伸，最后被包裹的底物（例如蛋白质聚集体，感染因子和受损线粒体）与自噬体融合后最终在溶酶体中降解。

华东师范大学博士学位论文定量（label-freequantification，LFQ）也可用于相对和绝对定量[46]，因其操作简便和试剂成本较低，近几年得到广泛应用[47]。虽然这些策略都比单纯的蛋白质鉴定更复杂，但定量蛋白质组学对于我们理解疾病状态的生物过程和分子机制的变化至关重要。
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本文编号：2865307