研究背景脑卒中作为世界范围内人类第二大死因,其具体机制以及治疗措施一直是医学研究的热点。缺血-再灌注损伤时脑卒中造成脑损伤的主要机制,涉及到能量缺乏、氧化应激损伤、细胞兴奋性中毒、炎症效应等复杂机制。由于能量供应障碍和氧化应激损伤被认为是脑缺血-再灌注损伤的关键机制,因此引起了人们的关注。UCP2(mitochondrial uncoupling protein 2,线粒体解偶联蛋白2)是解偶联蛋白家族成员之一,主要功能是作为质子通道蛋白促进质子进入线粒体,降低膜电势,调控ATP的生成。UCP2在脑等组织中高表达,且在多种应激条件下活化,其活性增强可使线粒体内NAD~+(nicotinamide adenine dinucleotide,氧化型辅酶I)水平增高。NAD~+是细胞产能反应中重要的辅酶之一,参与了细胞内的糖酵解、氧化磷酸化等过程。因此,NAD~+水平与ATP生成密切相关NAD~+的水平调控着Sirtuins家族蛋白的活性。Srituins家族是第三类去乙酰化酶,其活化依赖于细胞内NAD~+水平,Srituins家族参与调控细胞氧化应激、能量产生、细胞生存/死亡等多个进程。SIRT3(NAD-dependent deacetylase sirtuin-3,线粒体去乙酰化酶3)是定位于线粒体的Sirtuins家族蛋白之一,参与了线粒体能量代谢和氧化还原状态的调节。因此,UCP2-SIRT3途径调控的能量代谢、氧化应激可能是神经细胞损伤的机制之一。目前认为,在细胞损伤过程中,最初的能量代谢、氧化应激等变化趋势与细胞损伤程度不一定呈现线性变化。在损伤过程的早中期,这些变化会作出代偿性反应,而这种增强的代偿性反应往往会在远期促进细胞功能障碍,并损伤细胞,整个细胞中这些变化呈现出现先增加后降低趋势,因此,需要我们继续探讨能量代谢、氧化应激导致神经细胞损伤的机制。研究目的:本实验利用线栓法建立c57小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,采用HE染色、TTC染色、WesternBlot等方法,检测脑组织在脑缺血-再灌注损伤中能量水平变化、氧化还原状态的变化,并使用UCP2特异性抑制剂京尼平,探讨UCP2-SIRT3途径在脑缺血-再灌注损伤中的作用。方法:1.于北京维通利华实验动物技术有限责任公司购买体重6周龄的c57BL/6雄性小鼠,采取随机方式分为5组:(1)假手术组(sham-operation);(2)缺血1h再灌注24h组(ischemia-1h);(3)缺血2h再灌注24h组(ischemia-2h);(4)京尼平处理假手术组(g-sham-operation);(5)京尼平处理缺血1h灌注24h组(g-ischemia-1h)。线栓法建立c57小鼠MCAO模型,再灌注24h后,对各组小鼠进行神经行为学评分,TTC和HE染色法观察各组小鼠大脑梗死面积,及梗死半区脑组织形态学变化。2.化学发光法检测脑组织中NAD~+/NADH、ATP、GSH,SOD活性和SIRT3活性的变化。3.Western Bolt法检测脑组织中UCP2、SIRT3、cleaved-caspase3水平的变化。结果:1.神经行为学评分、TTC染色及HE染色结果显示,缺血-再灌注后,小鼠的脑损伤随缺血时间延长而加重,脑梗死面积随缺血时间延长明显扩大;给予京尼平处理后,g-ischemia-1h组脑损伤明显改善,脑梗死面积减少。2.脑组织ATP检测结果显示,缺血-再灌注后,小鼠脑组织的ATP含量随缺血时间延长而明显降低;给予京尼平处理后,g-ischemia-1h组脑组织ATP含量与g-sham-operation相比无统计学差异,表明京尼平能有效维持缺血-再灌注损伤小鼠脑组织ATP含量。3.GSH水平与SOD活力检测结果显示,缺血-再灌注后,小鼠脑组织中GSH含量与SOD活力随缺血时间延长而明显降低;给予京尼平处理后,g-ischemia-1h组脑组织GSH含量与SOD活力与g-sham-operation组相比无统计学差异或有所增高,表明京尼平能有效降低缺血-再灌注损伤小鼠脑组织氧化应激水平。4.NAD~+/NADH和SIRT3活性检测结果显示,与sham-operation组相比,ischemia-1h组小鼠脑组织中NAD~+/NADH和SIRT3活性增高;给予京尼平处理后,g-ischemia-1h组脑组织NAD~+/NADH比值和SIRT3活性降低;5.Western Bolt结果显示,与sham-operation组相比,ischemia-1h组小鼠脑组织中UCP2和cleaved-caspase3蛋白表达明显增高,但SIRT3蛋白表达无明显变化;给予京尼平处理后,g-ischemia-1h组脑组织UCP2蛋白表达降低,cleaved-caspase3和SIRT3蛋白表达无明显变化。结论:1.脑缺血1/2小时-再灌注后,ATP浓度降低,GSH水平、SOD活力下降。脑缺血1h再灌注后,UCP2表达与SIRT3活性增强,NAD~+/NADH水平增高,脑缺血2h再灌注后,UCP2表达与SIRT3活性下降,NAD~+/NADH水平下降。提示UCP2、SIRT3早期发挥代偿,晚期发挥损伤作用,表明UCP2、SIRT3、介导氧化应激/能量代谢紊乱与脑缺血-再灌注组织损伤有关;2.京尼平能够抑制脑缺血1小时-再灌注UCP2表达,可以维持ATP水平,降低NAD~+/NADH水平和SIRT3活性,增强能量代谢,抑制氧化应激,进而减轻脑组织损伤程度,这进一步支持了UCP2、SIRT3、介导氧化应激/能量代谢紊乱与脑缺血-再灌注组织损伤有关。综上,我们推测UCP2-SIRT3信号通路通过能量代谢/氧化应激调控脑缺血-再灌注细胞损伤。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743
【部分图文】：
颈内动脉方向小心插入钝头线栓处，维持缺血 1h 后，拔出线栓，0mg/支，化学式为 C11H14O5，相抑制剂。结构见图 2.1。使用时配g 体重的比例对 c57 小鼠每天进
第 3 章 实验结果同缺血时间对小鼠脑缺血-再灌注损伤的影响同缺血时间对小鼠神经行为学评分的影响 Longa 等规定的的五级四分法，在对照组中每组随机选取 10 只分。结果显示：与 ischemia-1h 组相比，ischemia-2h 组模型的神高，这表明脑组织的损伤水平随着缺血时间延长而加重（图 3
3.2 不同缺血时间对 c57 小鼠脑梗死面积的影（means±SD,n = 5,*P<0.05）时间对小鼠海马 CA1 区损伤的影响察脑组织 CA1 区（图 3.3，放大倍数 400 倍鼠海马 CA1 区细胞排列混乱，细胞核固缩，并出现细胞损伤表现进一步加重。
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本文编号：
2866874
