iPS重编程及其分化神经细胞恶性转化模型的建立

发布时间：2020-11-05 18:54

　　 目的:体外构建源自iPS细胞的神经细胞恶性转化模型,以探讨恶性胶质瘤的细胞来源。方法:首先分离培养正常人皮肤成纤维细胞样本,提取细胞DNA,PCR扩增p53基因外显子5、6、7、8和NF1基因外显子22、32、33、38、47,测序鉴定突变热点位置有无突变。然后应用CytoTune?-iPS 2.0 Sendai试剂盒将皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞,定向分化为神经干细胞、神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,并应用免疫细胞化学方法鉴定,接着通过流式细胞仪技术筛选纯化同质的神经细胞群。最后,使用亚硝胺诱导星形胶质细胞恶性转化,并检测细胞生长速度、软琼脂克隆形成能力,初步评价其是否恶性转化。结果:正常人皮肤成纤维细胞体外分离培养后呈长梭形。抽提成纤维细胞DNA进行外显子测序发现,样本不携带NF1和p53突变体。重编程成纤维细胞培养14天后可在显微镜下可见小的干细胞克隆,提取其中四个细胞克隆,免疫荧光染色显示均表达Nanog、SSEA4、OCT4、TRA1-60、Sox2和TRA1-81这6个多能性标志分子,表明成功建立了iPS细胞系。iPS细胞定向神经分化后的免疫荧光染色结果显示细胞均表达特定的特异性标记物,表明神经干细胞、神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化成功。初步实验表明,亚硝胺处理星形胶质细胞后,细胞生长速度加快,软琼脂克隆形成能力增强。结论:成功重编程建立了iPS细胞,并在体外构建了源自iPS细胞的星形胶质细胞恶性转化模型,可为探讨恶性胶质瘤的细胞来源、特别是神经元能否恶变提供研究模型。
【学位单位】：武汉科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

图 1 正常人皮肤成纤维细胞的形态（100×）A. 样本 1；B. 样本 2；C. 样本 3；D. 样本 42.2 皮肤成纤维细胞 p53 基因和 NF1 基因测序结果

图 2 p53 基因 5、6、7、8 号外显子电泳结果M: DNA 分子量标记，1. 样本 1 2. 样本 2A. p53 基因 5 号外显子 B. p53 基因 6 号外显子C. p53 基因 7 号外显子 D. p53 基因 8 号外显子

3 NF1 基因 22、32、33、38、47 号外显子电M: DNA 分子量标记，1. 样本 1 2. 样本A. 样本 1 和样本 2 的 32、33 号外显子B. 样本 1 和样本 2 的 22、38、47 号外显B
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本文编号：2872042