星形胶质细胞CD59低表达参与视神经脊髓炎谱系疾病中枢神经系统特异性病灶的形成

发布时间：2020-11-07 11:32

　　 研究目的:视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一种严重的中枢神经系统特发性炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病,主要累及视神经和脊髓,有时累及脑部,多数由水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)抗体(AQP4-IgG)介导。AQP4是一种广泛表达的膜蛋白,不仅表达在中枢神经系统内的星形胶质细胞上,也表达在外周多个器官中;AQP4-IgG不仅存在于脑脊液中,也存在于循环血液中,而且循环血液中的AQP4-IgG滴度更高;但是NMOSD主要选择性地累及中枢神经系统,而外周器官很少受累,NMOSD这种中枢神经系统特异性病灶形成的原因尚不清楚。CD59是一种中枢神经系统内低表达而外周器官高表达的补体调节蛋白,其表达丰度会影响补体依赖的膜攻击复合物的形成。本课题的研究目的在于探索中枢神经系统内的CD59低表达是否参与了NMOSD中枢神经系统特异性病灶的形成。研究方法:采取免疫荧光染色的方法对比人和小鼠的中枢神经系统和外周器官的AQP4和CD59的表达情况。采用慢病毒为载体使小鼠脑内星形胶质细胞CD59过表达,然后小鼠脑内注射NMO病人血浆IgG(Immunoglobulin G isolated from NMO patient serum,IgG_(NMO))和人补体诱导NMOSD样病灶形成。利用AQP4、胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)、CD45、离子钙接头分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)和C5b-9免疫染色比较CD59过表达对病灶的影响。体外培养小鼠的胃组织和骨骼肌细胞、人的骨骼肌细胞和气管上皮细胞,利用慢病毒为载体向细胞转染短发卡核糖核酸(Short hairpin ribonucleic acid,shRNA)敲低细胞CD59或者中和性抗体阻断细胞或胃组织CD59的功能,然后向培养基中加入IgG_(NMO)和人补体。采用活死细胞染色和C5b-9免疫荧光染色评价CD59功能失活后的补体介导的细胞毒性(Complement-dependent cytotoxicity,CDC)。结果:CD59在中枢神经系统内的星形胶质细胞上几乎不表达,在外周器官上广泛表达并与AQP4共定位。小鼠脑内CD59过表达后,IgG_(NMO)和补体产生的AQP4、GFAP、MBP丢失和C5b-9减少,CD45和IBA1阳性面积减少。小鼠胃组织和骨骼肌细胞以及人骨骼肌细胞和气管上皮细胞的CD59失活后,IgG_(NMO)和人补体的细胞毒性减少,C5b-9阳性颗粒减少。结论:CD59在星形胶质细胞表达极低,在外周器官表达AQP4的细胞上广泛表达。CD59过表达可以减小小鼠脑内NMO样病灶,外周器官组织和细胞CD59失活增加AQP4抗体和补体介导细胞毒性。提示星形胶质细胞CD59低表达可能参与了NMOSD中枢神经系统特异性病灶的形成,脑内CD59过表达有可能成为NMOSD治疗的新方法。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R744.52
【部分图文】：

23图 1 CD59 在周围器官 AQP4 阳性细胞上高表达，而在星形胶质细胞不表达。（A）CD59（红色）在人骨骼肌、肾脏、小肠和支气管 AQP4 阳性细胞区域（绿色）高表达，在人脑内 GFAP（绿色）和 AQP4（绿色）阳性区域不表达。箭头示阳性区域，标尺=100μm.（B）WesternBlot 检测小鼠中枢神经系统和外周各器官的 CD59 表达量。β-actin 为内参。（C）CD59（红色）在小鼠骨骼肌、肾、胃和小肠内 AQP4（绿色）阳性区域高表达，在大脑和脊髓内 GFAP（绿色）与 AQP4（绿色）的阳性区域不表达。箭头示阳性区域，标尺=50μm人和小鼠体内 AQP4 与 CD59 的表达关系，我们用表格的形式加以总结（表1），从表格中我们可以看出在外周各器官中，表达 AQP4 的组织同时表达 CD59，而在中枢神经系统内，星形胶质细胞的终足仅表达 AQP4 但不表达 CD59。

天津医科大学博士学位论文 实验结果27图3 小鼠脑内CD59过表达能够减小NMOSD病灶。小鼠脑内注射10 μl对照慢病毒或CD59过表达慢病毒 3 天后，分别注射 6 μl IgGcon或 IgGNMO加 4 μl 人补体的混合物，7 天后处死小鼠取脑做病理染色。其分组具体为：○1 对照病毒组小鼠注射 IgGNMO和人补体（ Conlenti+IgGNMO+hC ）； ○2 CD59 过 表 达 组 小 鼠 注 射 IgGNMO和 人 补 体（CD59lenti+IgGNMO+hC）；○3 对照病毒组小鼠注射 IgGcon和人补体（Conlenti+IgGcon+hC）（A）三组小鼠鼠脑注射点附近的 AQP4 染色、GFAP 染色、MBP 染色，标尺=1mm。（B）A 图中3 组小鼠统计出的 GFAP 染色、AQP4 染色和 MBP 染色的丢失面积（mean ±S.E. n = 5）。（C）A 图中 Conlenti+IgGNMO+hC 组的病灶侧和对侧的放大图。标尺=100μm。IgGcon+hC 注射组相比，IgGNMO+hC 注射组小鼠鼠脑注射点附近区域的 AQP4、GFAP、MBP 丢失非常明显（P<0.001），星形胶质细胞破坏和髓鞘脱失严重，证实了我们的 IgGNMO+hC 鼠脑注射造模方法的可靠性，其病灶侧和对侧细节进一步展示在放大图中（图 3C）：GFAP 染色可见对侧的星形胶质细胞未活化，病灶侧核心区星形胶质细胞完全脱失

36图 9 人体外周表达 AQP4 的器官的组织细胞上的 CD59 能够增加 AQP4-IgG 和补体介导的细胞毒性。人原代气道上皮细胞（HTEpiC）（A-D）CD59 沉默慢病毒（CD59-RNAi）或对照病毒感染 3 天后（A 和 B）或者 CD59 中和性抗体 Bric229 或对照抗体孵育半小时后（C 和
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本文编号：2873885