突变亨廷顿蛋白抑制突触小泡蛋白2C表达和突触小泡运输

发布时间：2020-11-10 04:31

　　 亨廷顿病(huntington's disease,HD)是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病,由编码亨廷顿蛋白(huntingtin,Htt)的基因第一外显子中CAG重复序列异常增多导致Htt氨基末端谷氨酰胺异常扩展。Htt在全身广泛表达,但病理学上突变的Htt最早选择性地引起纹状体中等棘投射性神经元(medium-size spiny projecting neurons,MSNs)死亡,随着病程进展,其他脑区如大脑深层皮质、海马、下丘脑等也受波及。纤维联系上,纹状体MSNs接受皮质神经元的纤维投射,传出纤维主要到达内外侧苍白球和黑质网状部。HD早期症状与突触功能异常有关。许多研究表明,突变Htt对突触功能具有明显毒性,如干扰突触小泡的转运,破坏突触小泡的结构,抑制神经递质的摄取和释放,影响突触蛋白的表达或翻译后修饰等。突触小泡蛋白对突触小泡功能的维持和调节十分重要,其表达和功能异常将影响突触功能。突触小泡蛋白2(synaptic vesicle protein 2,SV2)是一类跨膜糖蛋白,主要定位于神经元突触小泡和内分泌细胞分泌颗粒膜上。SV2家族有A、B、C三个亚型,其中SV2A和SV2B在脑内的分布较广泛,SV2C的分布较局限,其表达脑区主要包括纹状体、苍白球、黑质、中脑、嗅球等旧脑区和海马的CA3和齿状回区,与HD受累区域相似。SV2是影响突触小泡或分泌颗粒释放递质或激素分泌的重要分子。敲除SV2A小鼠出现严重癫痫样发作,脑片GABA递质释放大大减少;肾上腺髓质嗜铬细胞储存池分泌颗粒数目和大小不变,但准备释放池明显减小。干扰胰岛β细胞和INS-1E(大鼠胰岛素分泌细胞株)细胞内SV2A和SV2C,K~+刺激的胰岛素分泌不减少,但高糖刺激下胰岛素的分泌明显减少,尤其以干扰SV2C时减少最为明显。SV2氨基酸序列与细菌的转运蛋白具有较高同源性,提示其可能是一类转运蛋白。有研究认为,SV2可作为支架蛋白参与囊泡形状的调节和转运稳定性的维持。但目前未见SV2是否参与突触小泡或内分泌颗粒运输的报道。本研究首先检测了突变Htt对SV2家族A、B、C三个亚型蛋白表达的影响,在观察到突变Htt选择性抑制SV2C亚型表达的基础上,分析了SV2C在突触小泡运输中的作用及突变Htt影响SV2C表达的病理学意义。1.突变Htt选择性抑制SV2C的表达已有研究证明,HD中的神经病理损害与突变Htt通过转录水平干扰多种突触小泡蛋白的表达有关。为了了解突变Htt是否通过影响SV2的表达而参与HD的发生,首先检测了HD转基因小鼠脑内SV2的表达。免疫印迹检测发现,在表达含82个谷氨酰胺重复序列的人Htt氨基末端171个氨基酸的N171-82Q HD转基因(TG)小鼠脑内,SV2A水平在第16周有所增加,在第14周和第20周与野生型(WT)小鼠相近;SV2B在各期TG小鼠脑内无明显变化,而SV2C在第14周TG小鼠脑内开始明显减少,在第16周和第20周进一步降低。免疫组织化学染色显示,TG小鼠各个脑区SV2A免疫反应性仅在第16周略有增强,SV2B免疫反应性无变化,而SV2C免疫反应性则在14~20周TG小鼠纹状体、外侧和内侧苍白球、黑质网状部等脑区均显著降低。RT-PCR检测表明,3种SV2 mRNA表达水平的变化模式与其蛋白水平的变化模式十分相似。在转染表达突变Htt(Htt-120Q)的N2a细胞(以转染表达Htt-20Q的N2a细胞为对照)中,免疫印迹和RT-PCR分析进一步证明了突变Htt可明显抑制SV2C的表达,轻度上调SV2A的表达,不影响SV2B的表达。以上结果表明,突变Htt主要选择性抑制SV2C的表达。2.SV2C参与突触小泡运输SV2C在HD累及脑区高水平选择性表达和突变Htt选择性抑制SV2C的表达均提示,HD神经病理学损害(如突触功能障碍)可能与突变Htt通过抑制SV2C的表达而影响其功能有关。已知突变Htt对神经元内物质运输具有抑制作用,突触小泡在神经元内的正常运输与正常突触功能的维持关系密切。为了明确SV2C是否参与突触小泡的运输,首先检测了SV2C在不同突触小泡的定位特征,然后应用光漂白后荧光恢复(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技术分析了沉默SV2C对神经细胞内突触小泡运输的影响。在N2a细胞中分别转染标记致密核心大突触小泡的质粒pDsRed-NPY、标记小突触小泡的质粒pEGFP-VAchT和标记大小两种突触小泡的质粒pEGFP-VAMP2,SV2C免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察显示,SV2C在分化的N2a细胞中既分布在大突触小泡上,也分布在小突触小泡上。随后用pEGFP-VAMP2和沉默SV2C的小干扰RNA质粒pmCherry-SV2C-siRNA共转染N2a后,以FRAP技术分析显示,与共转染pEGFP-VAMP2和siRNA对照质粒的N2a细胞比较,沉默SV2C的细胞内EGFP-VAMP2标记的突触小泡在漂白后荧光恢复的强度比和速率均显著降低,即沉默SV2C后突触小泡轴突转运减弱,表明SV2C参与神经细胞内大小突触小泡的运输。3.突变Htt通过下调SV2C表达抑制突触小泡运输为了证明突变Htt通过抑制SV2C的表达影响突触小泡的细胞内运输,检测了上调SV2C表达是否可减弱突变Htt对细胞内突触小泡运输的抑制。(1)过表达SV2C显著减弱突变Htt对突触小泡运输的抑制:在N2a细胞中共转染pmCherry-Htt-20Q和pEGFP-VAMP2或pmCherry-Htt160Q和pEGFP-VAMP2后进行FRAP检测显示,与表达正常Htt(mCherry-Htt-20Q)的细胞比较,表达突变Htt(pmCherry-Htt-160Q)的N2a细胞内EGFP-VAMP2标记的突触小泡运输明显减慢。进一步在共转染pEGFP-VAMP2、pmCherry-Htt-160Q和pCFP-SV2C或pEGFP-VAMP2、pmCherry-Htt-160Q和pCFP的N2a细胞中的FRAP观察发现,过表达SV2C可明显减轻突变Htt对EGFP-VAMP2标记的突触小泡运输的抑制。(2)丁酸钠减弱突变Htt对SV2C转录的下调并改善突变Htt对突触小泡运输的抑制:本实验室另有研究证明,阻遏子元件沉默转录因子(repressor element silencing transcription factor,REST)是SV2C的转录抑制因子。组蛋白去乙酰化酶1/2(histone deacetylase1/2,HDAC1/2)通过促进REST的作用负性调控相应靶基因的转录,突变Htt对HDAC活性具有促进作用。为了检验突变Htt是否通过促进HDAC活性抑制SV2C的表达,检测了HDAC1/2选择性抑制剂丁酸钠对SV2C基因转录表达的影响。应用不同浓度(10~100μmol/L)的丁酸钠处理转染表达突变Htt的N2a细胞后免疫印迹和RT-PCR分析显示,20~30μmol/L丁酸钠能显著抑制突变Htt对SV2C mRNA和蛋白的下调作用,较低(10μmol/L)或更高(50~100μmol/L)浓度的丁酸钠则无明显作用。由此可见,合适浓度的丁酸钠可在一定程度上纠正突变Htt对SV2C基因的转录抑制作用。为了进一步证明突变Htt通过抑制SV2C的表达而影响突触小泡的运输,继而分析了丁酸钠对突变Htt抑制突触小泡运输效应的影响。FRAP检测发现,在共转染表达EGFP-VAMP2和mCherry-Htt-160Q的N2a细胞中,30μmol/L丁酸钠处理能明显缓解突变Htt对EGFP-VAMP2标记的突触小泡运输的抑制。结论:突变Htt可选择性抑制突触小泡蛋白2C(SV2C)的转录表达;SV2C参与神经细胞内突触小泡的运输;突变Htt可通过促进对阻遏子元件沉默转录因子(REST)活性具有激活作用的组蛋白去乙酰化酶1/2(HDAC1/2)的活性,抑制SV2C的转录表达和突触小泡的运输。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R742.2
【部分图文】：

结 果1.突变Htt选择性抑制SV2C的表达 已知突变Htt 可通过干扰多种突触小泡蛋白的表达损害突触功能，SV2 作为突触小泡表面的高丰度膜蛋白，功能重要，三个亚型蛋白在脑内的分布各有其特点，那么突变 Htt 是否通过影响 SV2 的表达而参与 HD 的发生？为了弄清这一问题，首先检测 HD 转基因小鼠（TG 鼠）脑内 SV2 的表达有无改变。分别取第 14 周、第 16 周和第 20 周的正常野生型（wildtype，WT）小鼠和 TG 小鼠，代表疾病的早期、中期和晚期，应用免疫印迹技术检测 SV2 脑蛋白表达的变化。发现：与 WT 小鼠比较，TG 小鼠脑内 SV2A 蛋白水平在第 16 周有所增加，在第 14 周和第 20 周与 WT 小鼠相近；SV2B 蛋白的表达在 TG 小鼠脑内无明显变化；而 SV2C 蛋白表达在第 14 周 TG 小鼠脑内开始明显减少，在第 16 周和第 20 周进一步降低。（图 1）。

图 2.TG鼠脑纹状体、黑质和海马SV2A水平免疫组织化学检测，显示其免疫反应性广泛性增强。Str-LGP，纹状体-外侧苍白球；SN，黑质；Hipp，海马；比例尺，100 μm。图 3. TG 鼠脑纹状体和海马 SV2B 水平免疫组织化学检测，显示其免疫反应性不变。

21 3. TG 鼠脑纹状体和海马 SV2B 水平免疫组织化学检测，显示其免疫反应性P，纹状体-外侧苍白球；Hipp，海马；比例尺，100 μm。图 4. TG 鼠脑纹状体、黑质和海马 SV2C 水平的免疫组织化学检测，显示降低。Str-LGP，纹状体-外侧苍白球；SN，黑质；Hipp，海马；比例尺，10
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本文编号：2877480