二甲双胍和白藜芦醇对胶质瘤细胞上皮间质转化的抑制作用及机制的研究

发布时间：2020-11-14 10:39

　　 研究背景及目的:脑胶质瘤(glioma)是中枢神经系统常见的原发性肿瘤,具有恶性程度高、治疗困难、预后差、频繁复发等特点。胶质瘤的标准治疗方法是以手术切除肿瘤,同时结合放疗、化疗等辅助治疗的综合治疗方法。虽然胶质瘤的诊疗技术不断的进步与发展,但目前胶质瘤的治疗现状仍不乐观。胶质瘤细胞具有高度的迁移和侵袭能力,常造成肿瘤细胞的广泛侵袭,给胶质瘤的治疗带来极大的困难。因此探讨导致胶质瘤细胞高迁移和高侵袭特性的分子机制,并研究相应的靶向药物,已成为当前胶质瘤治疗中亟待解决的问题。近来的大量研究证据表明,上皮间质转化(EMT)与肿瘤的侵袭、转移、进展有密切联系,EMT是肿瘤侵袭与转移中的关键生物学过程,肿瘤细胞发生EMT会导致肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增加。而且,EMT还与肿瘤干细胞(CSCs)紧密联系,而CSCs也是肿瘤发生侵袭、转移、耐药、复发的重要原因,因此如能找到靶向胶质瘤EMT的方法,不仅可以抑制胶质瘤EMT,而且还可以调控胶质瘤的干细胞性质,这无疑会给胶质瘤的治疗带来新的突破。二甲双胍是一种被广泛应用的降糖药物,白藜芦醇是一种天然的多酚类化合物。近年来研究发现,二甲双胍和白藜芦醇不仅可以发挥抗肿瘤效果,更重要的是可以调控肿瘤细胞的EMT过程。但这两种药物对胶质瘤EMT过程的抑制作用,尚未见系统研究过。本研究旨在研究胶质瘤细胞发生EMT改变以及二甲双胍和白藜芦醇对胶质瘤EMT改变的抑制作用及分子机制。方法:在本研究中,我们利用TGF-β1诱导胶质瘤细胞发生EMT改变,观察EMT对胶质瘤细胞生物学性能的影响,应用二甲双胍和白藜芦醇作为胶质瘤EMT的干预药物。通过免疫印迹、划痕试验、Transwell侵袭试验、肿瘤球形成试验等方法,分析和研究二甲双胍和白藜芦醇对胶质瘤发生EMT的抑制作用以及对EMT获得的肿瘤干细胞性能的调控作用,并探讨可能的作用机制。结果:1.TGF-β1可以诱导胶质瘤细胞发生上皮间质标志物的转变,使细胞形态变得拉长、伸长,增加胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力,表明TGF-β1可以诱导胶质瘤细胞发生EMT改变,并建立诱导胶质瘤EMT改变的模型。2.干扰转录因子ZEB1在胶质瘤的表达,可抑制胶质瘤细胞上皮间质标志物的转变,并抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭,从而抑制胶质瘤细胞发生EMT。3.胶质瘤细胞发生EMT能增加胶质瘤的自我更新能力、上调肿瘤干细胞标志物的表达,表明EMT可使胶质瘤细胞获得肿瘤干细胞的性质。4.二甲双胍和白藜芦醇可以抑制胶质瘤细胞上皮间质标志物的表达,并抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力,表明二甲双胍和白藜芦醇能抑制胶质瘤发生EMT改变。5.二甲双胍和白藜芦醇分别通过抑制AKT/m TOR通路和Smad依赖通路抑制胶质瘤EMT改变。6.二甲双胍和白藜芦醇能有效抑制胶质瘤EMT获得的细胞自我更新能力和干细胞标志物的表达,表明它们能抑制胶质瘤EMT获得的肿瘤干细胞性质。结论:1.证明胶质瘤LN18和U87细胞在一定条件下能发生EMT。2.ZEB1在胶质瘤细胞EMT发生中起关键调控作用。3.胶质瘤细胞发生EMT可使胶质瘤细胞获得肿瘤干细胞性质。4.二甲双胍和白藜芦醇能抑制胶质瘤细胞EMT改变、抑制细胞的迁移和侵袭。5.二甲双胍和白藜芦醇分别通过抑制AKT/m TOR通路和Smad依赖通路抑制胶质瘤细胞EMT 6.二甲双胍和白藜芦醇能抑制胶质瘤EMT获得的肿瘤干细胞性质。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

图 1.1 EMT 的分型[11]Figure1.1 Different types of EMT[11]1.2.3 EMT 的标志物EMT 的发生常伴随多种上皮和间质分子标志物的变化。发生 EMT 时，上皮分子标志物 E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下调，而间质分子标志物 N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤维连接蛋白（fibronectin）、β-连环蛋白（β-catenin）等表达上调。E-钙黏蛋白是细胞之间的重要黏附分子，EMT的特点之一是细胞间的黏附丧失和 E-钙黏蛋白表达减少，E-钙黏蛋白表达下调是 EMT 重要的标志性改变[12]。N-钙黏蛋白也是 EMT 的重要间质分子标志物，在上皮性肿瘤中 N-钙黏蛋白表达的上调，往往导致细胞的迁移和侵袭能力增强。即 EMT 过程会出现 E-钙黏蛋白到 N-钙黏蛋白的转换（E- to N-cadherinswitch），称“钙黏蛋白转换（cadherin switch）”，已成为 EMT 广泛使用的标

图 1.2 EMT 涉及到的信号通路[50]Figure1.2 Signaling pathways involved in EMT[50]1.4.3 靶向与 EMT 有关的非编码 RNAs某些微小 RNA（smicroRNAs, miRNAs）和长链非编码 RNA（slong noncodingRNAs, lncRNAs）主要通过调节 EMT 诱导转录因子或（和）EMT 信号通路的表达来调控 EMT[52,53]。miRNAs 能促进或阻遏 EMT 发生。如 miRNA-361-5p能调节 Twist1 而抑制胶质瘤细胞 EMT[54]。过表达的长链非编码 RNA PTCSC3可以通过下调 Wnt 信号通路抑制胶质瘤 U87 细胞 EMT[55]。靶向与 EMT 有关的miRNAs 或长链非编码 RNAs，已成为干预 EMT 的策略之一。1.4.4 靶向 EMT 标志物EMT 的特点是丧失上皮性标志物（如 E-钙黏蛋白、β-连环蛋白、细胞角蛋

图 2.1 ZEB1 shRNA 质粒图谱Figure2.1 The plasmid profile of ZEB1 shRNA质粒的转化与扩增：（1）取 50 μl 大肠杆菌感受态细胞，按不同的分组分别加入适量 As（shZEB1-1 or shZEB1-2）和 Control shRNA（shCtrl）质粒（体积 μl），混合均匀。（2）冰上孵育 30 min 后，42℃水浴锅内热激 90 s，马上放回冰上，（3）加入 400 μl 37℃的 LB 培养基，于 37℃ 摇床慢摇振荡培养 45-6（4）取 的菌液涂在含有氨苄青霉素（50 μg/ml）的 LB 固体培养基上培养过夜。（5）利用无菌的枪尖挑选单个菌落，放入5 ml的 LB培养基中（含50
【参考文献】

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1 Michael A Lea;Jacob Pourat;Rupali Patel;Charles desBordes;;Growth inhibition of colon cancer cells by compounds affecting AMPK activity[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年07期

本文编号：2883383