人胚胎干细胞的神经干细胞诱导分化及神经干细胞分泌的微囊泡对坐骨神经缺损性损伤的修复作用研究

发布时间：2020-11-18 02:30

　　 研究背景:由于地震、车祸等灾难的发生,坐骨神经等周围神经的损伤是临床的常见疾病。目前,自体神经移植仍然是修复周围神经损伤的主要方法,但是自体神经移植法具有供体来源有限、增加供区创伤以及残留供区感觉功能障碍等缺陷。周围神经再生是现阶段神经生物学领域的研究重点,组织工程领域的一些新发现为长节段缺损性损伤提供了新手段。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)可分化为各种类型的神经细胞,将其移植到损伤处可促进轴突再生以及髓鞘形成。课题组此前通过培养人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)发现胚胎干细胞可以自发分化形成神经干细胞。由此我们推测这种人胚胎干细胞能够在特定条件下定向诱导分化成纯度较高的神经干细胞(human embryonic stem cell derived-neural stem cells,hESC-NSCs)。由于神经干细胞来源的局限性,从hESCs分化而来的NSCs显得尤为重要。能否高纯度、高产量的获得NSCs是其能否应用到临床细胞治疗的关键问题。我们猜测,hESC-NSCs同胎脑来源的NSCs具有同样促进轴突再生的作用,对此后续的研究表明,hESC-NSCs确实可以通过间接作用促进轴突再生。现在越来越多的研究表明NSCs发挥修复神经损伤的作用不是通过细胞直接整合而是通过分泌因子发挥作用,并且由于NSCs是有核的活细胞,具有形成肿瘤的风险。微囊泡(microvesicles,MVs)是从细胞条件培养基中分离得到的活性有形成分,是细胞同周围细胞或环境进行信息和物质传递的一种物质。并且我们组之前已经研究证明过间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的微囊泡(MSCs-MVs)可以促进坐骨神经压榨性损伤后的再生修复。因此,我们猜测人胚胎干细胞源神经干细胞分泌的微囊泡(microvesicles released from human embryonic stem cell derived-neural stem cells,hESC-NSC-MVs)与MSCs-MVs具有类似的促进轴突再生的功能,并对其展开进一步的研究。研究目的:研究人胚胎干细胞的神经干细胞诱导分化及胚胎干细胞源神经干细胞分泌的微囊泡对大鼠坐骨神经5mm缺损性损伤的修复作用。研究方法:(1)将无饲养层培养的hESCs定向诱导为神经干细胞,并利用细胞形态学、免疫荧光、PCR的方法进行鉴定。(2)利用PCR和流式细胞术对神经干细胞经过贴壁-球转化(AST)后提高干性进行说明。(3)收集hESC-NSCs的无血清培养基(条件培养基),运用超速离心法提取微囊泡。(4)将hESC-NSC-MVs与背根神经节共培养,测定轴突的长度。(5)建立SD大鼠坐骨神经缺损性损伤模型,应用坐骨神经功能指数(sciatic nerve functional index,SFI)、HE染色、Masson染色等方法评价hESC-NSC-MVs对大鼠坐骨神经损伤修复作用。研究结果:(1)hESCs可以分化为神经干细胞,并且神经干细胞相关标志Nestin,Pax6等在P8 NSCs附近表达最高。(2)神经干细胞经过AST,神经干细胞相关标志Nestin,Pax6等表达升高,干性增强。(3)hESC-NSC-MVs与背根神经节共培养的再生轴突长度优于PBS组。(4)成功的构建出大鼠坐骨神经缺损性损伤模型。神经损伤后12周,hESC-NSC-MVs组受损侧后肢形态学恢复和再生轴突的增加都较hESC-NSCs组和PBS组明显。结论:(1)hESC可以分化为NSCs,hESC-NSCs表达神经干细胞标志。(2)hESC-NSCs可以通过贴壁-球转化提高神经干细胞标志的表达以及增强干性。(3)hESC-NSC-MVs对坐骨神经缺损性损伤具有修复作用。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R745
【部分图文】：

边缘清晰光滑（图3.1A）。在神经诱导液中培养约 18d 后，细胞开始呈椭圆形、三角形、双极型或三极型。当达到 75%以上的融合度时，消化细胞并重新接种在 Matrigel 培养皿，这些细胞可以传代至少 50 代（目前还能继续往下传代），同时保持其特有的形态大致不变，并可反复冻存和复苏（图 3.1B-D）。通过 PCR 和免疫荧光分析，检测 NSCs 标志物的表达情况。与 hESCs 相比，Pax6、Sox 1 等神经干细胞基因在 hESC-NSCs 中明显上调，而多能干性基因 Oct 4 表达下调（图 3.1 E）。图3.1：hESCs及hESC-NSCsA：生长在matrigel上的hESCs形态；B-D：P8

15分析显示，hESC-NSCs细胞表面表达CD 44和CD 133，弱表达O1，而Neisin、β-IIItubulin和GFAP在hESC-NSCs的细胞质中表达（图3.2 C-D）。图3.2：P8 hESC-NSCs神经标志物的表达及细胞定位A-B：hESC-NSCs的Nestin (A)和Pax6 (B)免疫荧光染色；C-D：P8 hESC-NSCs细胞膜表达Nestin, β-III tubulin, GFAP, O1, CD133 and CD44的分析(C)；细胞内表达 Nestin, β-III tubulin,GFAP的分析(D)（A-B：Scale bars 50 μm）。Fig.3.2 Cellular localization of P8 hESC-NSCs markersA-B: hESC-NSCs were immunofluorescence staining for Nestin (A), Pax6 (B). C-D: Cellsmembrance analysis of Nestin

16这些hESC-NSCs可传代50代，且形状大致保持不变。我们使用P2、P8和P18hESC-NSCs来观察Nestin、Pax6、Sox1、Sox2的表达（图3.3A）。流式细胞仪分析显示，Nestin、β-III tubulin、GFAP、O1、CD133在P2、P8和P18 hESC-NSCs中的表达(图3.3B)。图3.3 不同代数的hESC-NSCs上神经标志物的表达A：定量 PCR 分析 Nestin，Pax6，Sox1，Sox2 在 P8 hESC-NSCs，P18 hESC-NSCs 的表达水平，以 P2 hESC-NSCs 作对照（n=3，*p<0.05
【参考文献】

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5 杨光;尹维田;薛金伟;李春雨;范东艳;;骨髓间充质干细胞移植修复大鼠坐骨神经挤压伤(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年25期

6 李彬;陈洪伟;胡智兴;谭韬;金立方;王淑芬;季维智;;人胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞[J];动物学研究;2007年03期

7 熊革;王炎;童德迪;皮彦斌;郑炜;张友乐;;免疫抑制剂对大鼠坐骨神经损伤修复后细胞因子表达的影响[J];中国修复重建外科杂志;2006年12期

8 ;Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J];Chinese Medical Journal;2005年23期

9 杜英,阮丽荣,李倩如,杨波,赵新利,李红伟,宋来君,张清勇;免疫磁珠法分离和纯化人胚胎神经干细胞[J];郑州大学学报(医学版);2003年01期

10 王彦惠 ,刘振华 ,廖可立 ,姜晓丹 ,徐如祥 ,李留洋 ,彭杰,柳息洪;免疫磁珠体外提纯胚胎大鼠神经干细胞的实验研究[J];解放军医学杂志;2002年11期

本文编号：2888233