天然产物葫芦素D抗胶质母细胞瘤及其作用机制研究

发布时间：2020-11-20 12:34

　　 胶质瘤是临床上最为常见的原发性脑肿瘤,患者的生存中期仅为12到14个月,5年生存率低于5%。胶质瘤中一小部分具有干性的胶质瘤干细胞是手术治疗后复发以及形成耐药的主要原因,至今依旧没有特效药物可以彻底治疗胶质瘤。在本研究中,我们通过带有Nestin-GFP报告基因的胶质瘤细胞系高通量筛选天然产物化合物库从中发现了葫芦素D。葫芦素D可以剂量依赖性地抑制胶质瘤细胞(A172,U87-MG,U251)的活性和生长,其对应IC50值分别为700nM,150nM,200nM。进一步的研究表明葫芦素D通过抑制金属蛋白酶(MMP)降低了胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。经过流式细胞分析得知,葫芦素D处理的细胞被阻滞在G2/M期,细胞增殖相关蛋白Ki-67表达减少,DNA合成受到抑制,这些则是由葫芦素D诱导的P53表达增强和ERK磷酸化减少(失活)导致的。与此同时葫芦素D能破坏线粒体功能导致呼吸链受损、活性氧水平上升从而诱导胶质瘤细胞凋亡,表现为Annexin V阳性细胞的显著增加。在与胶质瘤治疗一线药物替莫唑胺联用时葫芦素D显示出较强的协同作用。进一步的分子机理研究显示:STAT3,AKT1磷酸化激活被抑制,因此导致下游干性相关基因Sox2,Oct3/4,htert以及胶质瘤干细胞标志物CD133,Nestin,Olig2等的表达下调,而胶质细胞分化标志物Gfap,Mbp的表达上升。在肿瘤异种移植实验中,葫芦素D有效抑制了异种移植胶质瘤的生长,且表现为极低的生理毒性。综上所述,我们首次发现了葫芦素D作为潜在的抗胶质瘤药物或胶质瘤治疗辅助药物具有极大的临床应用价值,值得进一步深入研究。
【学位单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

18图 1 葫芦素 D 抑制了胶质瘤细胞的生长：（A）三种胶质瘤细胞系 A172，U87，U251 在不同葫芦度 D 浓度下处理 24 小时后的细胞形态变化。（B）葫芦素 D 化学结构式。（C）葫芦素 D 剂量依赖性抑制胶质瘤细胞生长。（D）不同浓度葫芦素 D 处理下胶质瘤细胞的生长曲线。（E,F）不同浓度葫芦素 D 处理下培养 21 天后，处理组较对照组集落形成数目大大减少（F）是对集落数目的统计。重复试验一式三份且结果一致，P 值已在图中显示。袭对 GBM 的转移很重要，经葫芦素 D 处理的细胞比对照组穿过铺有基质胶的基底膜的数量有所减少（从大约 300 到 150）（图 2D），证实了葫芦素 D 降低了细胞的机动活性和生存活性。在以往研究中报道过基质金属蛋白酶（MMP）在多种癌症的转移中起到重要作用，MMP 可通过细胞外基质的分解直接促进细胞迁

19图 2 葫芦度 D 抑制了胶质瘤细胞的迁移和侵袭:（A,B）划痕后在有葫芦素 D 存在的情况下愈合速度变慢（B）是对平均迁移距离的统计结果。（C,D）在有葫芦素 D 存在的情况下，穿过 Transwell 基质胶的细胞数目明显变少，（D）是对穿过细胞数目的统计。（E,F）在有葫芦素 D 的情况下，胶质瘤单细胞迁移速度明显减小，（F）是对迁移速度的量化统计。（G,H）经葫芦素 D 处理后，MMP1 表达量降低。（H）是对 WB 结果的量化。重复试验一式三份且结果一致，P 值已在图中显示。4.4 葫芦素 D 通过阻碍 G2/M 期抑制细胞增殖前面的结果显示，葫芦素 D 剂量依赖性抑制 GBM 细胞的增殖。为了揭示其

我们采用了 PI 染色实验分析细胞周期来研究葫芦素 D 对 GBM 细胞周期控制的影响（图 3.1A）。与对照组相比，处理组导致 GBM 在 G2/M 期的细胞比例增加（图3.1B）。细胞周期停滞在G2/M期使得进入G1或G0期的细胞减少，这种结果可致使受损的 GBM 细胞增强凋亡，从而增加化疗的细胞毒性。进一步WB 结果表明葫芦素 D 通过增强 P53 表达，阻止 Erk 磷酸化来调节细胞周期和增殖（图 3.2F）。同样的，Ki-67 蛋白的细胞含量与细胞周期进展、肿瘤恶性程度密切相关，葫芦素 D 处理后 Ki-67 阳性细胞比例降低（图 3.2B）。BrdU 结果也显示随葫芦素 D 浓度的升高而降低，表明细胞 DNA 的合成与复制受到抑制（图3.2D）。图 3.1 葫芦素 D 阻碍胶质瘤细胞周期：随着葫芦素 D 浓度升高，细胞 G2/M 期细胞所占比例逐渐增多（A）
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本文编号：2891418