2型囊泡谷氨酸转运体在神经病理性疼痛中的作用及其表达调控机制研究
发布时间：2020-12-11 09:05
研究背景谷氨酸在疼痛信息的感知、传递和调控中发挥了重要作用。研究证实,谷氨酸的过度释放与神经病理性痛的发生发展密切相关。囊泡谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporters,VGLUTs）是突触前负责将谷氨酸转运到囊泡内的转运体蛋白质,因此对以胞吐形式释放的谷氨酸能神经递质具有重要的调控作用。目前已知的VGLUTs包含三种亚型,其中2型囊泡谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2）主要分布于背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）、脊髓、脑干和丘脑等与疼痛信号传递和加工密切相关的部位或区域。有文献报道VGLUT2全身敲除杂合子小鼠的神经病理性疼痛症状消失或减弱,同时VGLUT2全身敲除纯合子胎鼠丘脑神经元兴奋性突触后电流的幅度和频率下降;条件性敲除DRG中VGLUT2导致小鼠热痛觉过敏消失,但机械痛敏维持正常。以上研究提示,VGLUT2可能与疼痛,尤其是神经病理性痛有关,但在丘脑、脊髓及DRG中的作用有所差异。本实验室前期研究发现,神经病理性痛引起脊髓和丘脑等疼痛相关脑区VGLUT2...
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 神经痛模型动物脊髓VGLUT2表达变化
1 实验材料
2 实验方法
2.1 试剂配方
2.2 机械痛阈测定
2.3 坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型构建
2.4 真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2构建
2.5 PC12细胞转染
2.6 蛋白免疫印迹实验
2.7 免疫组化实验
2.8 组织免疫荧光双重标记实验
2.9 定量和统计分析
3 实验结果
3.1 VGLUT2抗体验证
3.2 SNI神经病理性痛模型的构建及验证
3.3 SNI术后不同时间点脊髓VGLUT2表达变化
4 小结
第二部分 VGLUT2shRNA慢病毒对神经痛及谷氨酸释放的影响
1 实验材料
2 实验方法
2.1 试剂配方
2.2 含GFP荧光标记的VGLUT2shRNA慢病毒载体构建
2.3 表达VGLUT2shRNA的慢病毒载体包装
2.4 原代神经元培养
2.5 细胞免疫荧光实验
2.6 原代培养神经元的病毒感染
2.7 Real-timePCR和蛋白免疫印迹检测原代培养神经元VGLUT2表达
2.8 机械痛阈测定
2.9 SNI模型构建
2.10 鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒
2.11 丘脑VPL脑区微量注射VGLUT2shRNA慢病毒
2.12 原代培养神经元谷氨酸释放实验
2.13 脊髓、丘脑突触体谷氨酸释放实验
2.14 定量和统计分析
3 实验结果
3.1 VGLUT2shRNA重组慢病毒载体制备与筛选
3.2 鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响
3.3 丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响
3.4 VGLUT2shRNA慢病毒对谷氨酸释放的影响
4 小结
第三部分 神经痛模型动物Wnt/β-catenin信号通路的变化及其在VGLUT2表达调控中的作用
1 实验材料
2 实验方法
2.1 药品配置
2.2 机械痛阈测定
2.3 SNI模型构建
2.4 Real-timePCR检测脊髓Wnt基因mRNA水平
2.5 蛋白免疫印记检测Wnt1、β-catenin蛋白表达
2.6 鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒、XAV939、Wnt激动剂、Wnt1、BDNF
2.7 定量和统计分析
3 实验结果
3.1 小鼠SNI术后不同时间Wnt/β-catenin信号分子的表达变化
3.2 Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响
3.3 BDNF对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响
3.4 Wnt/β-catenin信号通路介导的VGLUT2表达调控在神经痛中的作用
4 小结
讨论
结论
参考文献
主要简历
致谢
本文编号：2910257
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 神经痛模型动物脊髓VGLUT2表达变化
1 实验材料
2 实验方法
2.1 试剂配方
2.2 机械痛阈测定
2.3 坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型构建
2.4 真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2构建
2.5 PC12细胞转染
2.6 蛋白免疫印迹实验
2.7 免疫组化实验
2.8 组织免疫荧光双重标记实验
2.9 定量和统计分析
3 实验结果
3.1 VGLUT2抗体验证
3.2 SNI神经病理性痛模型的构建及验证
3.3 SNI术后不同时间点脊髓VGLUT2表达变化
4 小结
第二部分 VGLUT2shRNA慢病毒对神经痛及谷氨酸释放的影响
1 实验材料
2 实验方法
2.1 试剂配方
2.2 含GFP荧光标记的VGLUT2shRNA慢病毒载体构建
2.3 表达VGLUT2shRNA的慢病毒载体包装
2.4 原代神经元培养
2.5 细胞免疫荧光实验
2.6 原代培养神经元的病毒感染
2.7 Real-timePCR和蛋白免疫印迹检测原代培养神经元VGLUT2表达
2.8 机械痛阈测定
2.9 SNI模型构建
2.10 鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒
2.11 丘脑VPL脑区微量注射VGLUT2shRNA慢病毒
2.12 原代培养神经元谷氨酸释放实验
2.13 脊髓、丘脑突触体谷氨酸释放实验
2.14 定量和统计分析
3 实验结果
3.1 VGLUT2shRNA重组慢病毒载体制备与筛选
3.2 鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响
3.3 丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响
3.4 VGLUT2shRNA慢病毒对谷氨酸释放的影响
4 小结
第三部分 神经痛模型动物Wnt/β-catenin信号通路的变化及其在VGLUT2表达调控中的作用
1 实验材料
2 实验方法
2.1 药品配置
2.2 机械痛阈测定
2.3 SNI模型构建
2.4 Real-timePCR检测脊髓Wnt基因mRNA水平
2.5 蛋白免疫印记检测Wnt1、β-catenin蛋白表达
2.6 鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒、XAV939、Wnt激动剂、Wnt1、BDNF
2.7 定量和统计分析
3 实验结果
3.1 小鼠SNI术后不同时间Wnt/β-catenin信号分子的表达变化
3.2 Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响
3.3 BDNF对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响
3.4 Wnt/β-catenin信号通路介导的VGLUT2表达调控在神经痛中的作用
4 小结
讨论
结论
参考文献
主要简历
致谢
本文编号：2910257
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/2910257.html
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